Electroforesis de DNA

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Electroforesis de DNA
2
DNA Topoisomerasas
Izquierda Derecha
3
Enzimas de restricción
Clasificadas en 3 tipos, donde la mayoría
pertenece al grupo II (proteínas monoméricas,
poseen simetria rotacional y generalmente
requieren Mg2 Secuencias palindrómicas Isosquis
omeros Varias enzimas diferentes que reconocen
la misma secuencia, donde, algunas cortan sec
blanco en diferentes posiciones. Sma I / Xma I
Secuencias metiladas A N6-metiladenina C
5-metilcitosina Hpa II y Msp I Reconocen la
secuencia CCGG Hpa II no digiere DNA
metilado Msp I Digiere met o no-metilado 90 de
las metilaciones en genomas ocurren en
5.metilcitosina en CG
4
Clonamiento de DNA
5
Desfosforilación de vectores (para evitar
asociación intramolecular)
6
68 kDa
DNA Ligasa
Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)
7
Ligación de extremos cohesivos
8
Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, 503-517
Southern y Northern blot
9
Southern blot
10
Generación de cDNA
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Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e
hibridación in situ (en placa) Screening
Rastreo, Escrutinio
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Fago Lambda como vector de clonamiento
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Clonamiento de DNA en plasmidos
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DNA plasmidal
PBR322
15
Clonamiento de DNA en plasmidos
16
Clonamiento de DNA en plasmidos
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(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
Eliminación de fragmentos de Okazaki
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Eliminación de fragmentos de Okazaki (Reacción
de Nick translation)
Mg2
DNA pol I (E. coli) Holoenzima (monómerica) de
109 kDa. 5 ? 3 Polimerasa 5 ? 3
exonucleasa 3 ? 5 exonucleasa
Alternativamente Marcaje por random Primer o
incorporación en reacción de PCR
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SINTESIS de DNA in vitro
Reacción de polimerización en cadena
polymerase chain reaccion (PCR)
- Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA
templado) - Múltiples copias (de una molécula
templado ? 1 millon de copias) - DNA polimerasa
(termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq
Pol) - Partidores, un par (los partidores dan la
especificidad de la reacción) - dNTPs - Tampón
(Mg2, tampón) ? 30 ciclos de amplificacion
denaturacion 94ºC, 30seg
apareamiento, 40-60ºC,
30seg
extensión, 72ºC, 30seg
ESPECIFICIDAD VELOCIDAD SENSIBILIDAD
CONTROLES!
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SINTESIS DE DNA in vitro PCR
- Iniciacion, elongacion, terminacion
- in vitro
INICIACION cuando y donde
- multiples veces un fragmento de DNA
- par de partidores sentido y antisentido
secuencia especifica
- DNA polimerasa termoestable TaqPol
(Thermophylus aquaticus)
ELONGACION

• ciclos de denaturacion, apareamiento, extension

TERMINACION

• Extension final y guardar a 4ºC

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(No Transcript)
24
(No Transcript)
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PCR
Taq DNA pol (Thermus aquaticus) MW 65 kDa
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(No Transcript)
27
(No Transcript)
28
PCR de MICROSATELITES
GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA
GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC
GCTGTGATGGTCTAC
Marcadores genéticos Identidad, medico legal,
paternidad, etc
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Análisis de microsatélites de caballos
Sistema manual en geles de poliacrilamida
modificada, Spreadex en geles de 10 cm y tinción
con bromuro de etidio.
30
R-Loops
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R-Loops
Microscopía Electrónica, Tinción
Negativa Metodología alternativa Ensayos de
digestion con nucleasa S1, Degrada
preferencialmente ssDNA o RNA. También para
generar extremos romos y apertura del hairpin
generado en la segunda hebra del cDNA
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Replicación Viral Circulo rodante y
desplazamiento de hebra. (MET)
Tinción negativa
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Denaturación y Renaturación del DNA
Construcción de bibliotecas de secuencias únicas
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Denaturación del DNA e Hipercromicidad
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Marcaje de DNA satélite en cromosomas
FISH
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Separación de DNA por Ultracentrifugación
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(No Transcript)
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Secuenciación de DNA (Sanger,1977)
Enzima/ Propiedades Procesividad Velocidad de Polimerización
Frag. Klenow (DNA pol I) 10-50 nt 45 nt/seg
Sequenasa 2000-3000 nt 300 nt/seg
Taq DNA pol gt7600 nt 35-100 nt/seg
Klenow MW 76 kDa, carece de actividad 5 3
exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow,
1970). Sequenasa DNA pol T7 modificada
químicamente (sin activ. 3 ? 5 exonucleasa)
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Secuenciación de DNA (Sanger,1977)
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Secuenciación Automatizada de DNA
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AFLP

• DNA Fingerprinting
• AFLP
• Amplified Fragment polymorphism
• RFLP
• Restriction Fragment Length polymorphism
• RAPD
• Random Amplified polymorphic DNA
• DAF
• DNA Amplification Fingerprinting
• SSCP
• Single Strand Confirmational polymorphism
• Microsatellite

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Análisis de Microarreglos de DNA
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Microarreglos de DNA
44
Microarreglos de DNA
Síntesis in situ y análisis in silico
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Microarreglos de DNA
46
(No Transcript)
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Expresión Génica Temporal por microarreglos de
DNA
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(No Transcript)
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(No Transcript)
50
(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)