Components of a PCR and RAPD Reactions

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ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO
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Proyecto Genoma Humano

• El proyecto Genoma Humano (HGP) se inició en
  1990 y fue completado en 2003, fue coordinado por
  
• U.S. Department of Energy
• National Institutes of Health
• Wellcome Trust (U.K.) en los primeros años
• Otras contribuciones desde Japon, Francia,
  Alemania, China, y otros.

http//www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome
/home.shtml
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Beneficios del Proyecto Genoma Humano en Medicina

• Mejor diagnóstico (dx temprano, específico) de
  enfermedades genética e infecciosas
• Detección temprana de mayor susceptibilidad a
  enfermedades
• Mejor diseño de drogas
• Terapia génica y desarrollo de sistemas de
  control de drogas
• Farmacogenómica

4
(No Transcript)
5
Análisis del Polimorfismo

• RFLP - restriction fragment length polymorphism
  (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de
  restricción).
• AFLP - amplified fragment length polymorphism
• RAPD - random amplification of polymorphic DNA
• VNTR - variable number tandem repeat
• SSR - simple sequence repeat

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RFLP

• RFLP - restriction fragment length polymorphism
  (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de
  restricción).
• Tecnologia mas antigua
• Diferencia entre secuencias de DNA en la que un
  DNA presente una secuencia de restricción que el
  otro DNA no presenta.
• Los sitios de restricción son polimorficos

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RFLP

• Procedimiento
• Corte con enzimas de restriccion
• Separacion por electroforesis
• Transferencia de DNA a filtro (Southern)
• Hibridación sobre filtro La sonda utilizada
  debe reconocer la secuencia donde se encuentra el
  sitio de restricción

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LA ANEMIA FALCIFORME ES CAUSADA POR UNA MUTACION
PUNTUAL DNA CCT-GAG-GAG GEN NORMAL
(Hb A) Proteína Pro - Glu - Glu DNA
CCT GTG GAG GEN MUTANTE Proteína Pro -
Val - Glu Anemia Falciforme (Hb S) Enzima de
Restricción utilizada Mst I
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RFLP Analysis
10
(No Transcript)
11
RFLP Analysis
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• PCR RFLP
• PCR se obtiene la secuencia target (OJO aún
  cuando se obtenga un producto de tamaño definido,
  no necesariamente la secuencia de los productos
  es la misma)
• Digestión con enzimas de restricción
• Electroforesis en gel
• Transferencia e hibridación con sondas
  específicas si es necesario

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RAPD

• Random amplification of Polymorphic DNA
• (amplificación al random de DNA polimórfico)
• Primers de 10 bases
• 1 primer por reacción

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RAPD

• Los primers se unen a varios sitios en el DNA
  templado
• Sólo cuando los primers se hayan unido en sitios
  cercanos y estén orientados en direcciones
  opuestas, ocurrirá la amplificación

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RAPD
Template DNA
Primers apuntan hacia afuera, entonces no
ocurrirá la amplificación
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RAPD
Template DNA
Primers apuntan a la misma dirección, entonces la
amplificación no ocurrirá.
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RAPD
Template DNA
gt 2,000 bases
Primers están muy alejados, entonces la
amplificación no ocurrirá.
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RAPD
Template DNA
Los Primers están a una distancia apropiada,
ocurrirá la amplificación
100 - 1,500 bases
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VNTR

• VNTR ( Variable Number of Tandem Repeats)
  Repeticiones en tandem de número variable.
• Secuencias cortas (10 - 100 bp) repetidas dentro
  de los sitios de restricción (si el análisis se
  hace por RFLP), o los sitios donde se anclan los
  primers (si el análisis es por PCR).

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(No Transcript)
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VNTR Analysis
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4 repeticiones 9 repeticiones
17 pb
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(No Transcript)
24
VNTR Analysis
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SNPs
SNPs Single nucleotide polymorphism
(polimorfismo dado por la diferencia en un solo
nucleótido) Detección por PCR primers
diseñados con la misma secuencia pero con la
ultima base (extremo 3) cambiada según el
polimorfismo que se quiera detectar.
DNA Templado 3
5 5 3
primer
La DNA polimerasa no puede iniciar aquí la
extensión de la nueva cadena
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SECUENCIAMIENTO DE DNA Metodo de Sanger (uso de
dideoxynucleótidos ddNTPs)
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Se realizan 4 reacciones por separado, los
productos de cada tubo se visualizan en gel.
Figure 7-29a
28
Uso de dideoxynucleótidos en el secuenciamiento
marcados con agentes fluorescentes
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• APLICACIONES
• Análisis evolutivo de especies relacionadas
• Determinación de relaciones de filiación
• Determinación de marcadores asociados con
  virulencia o alguna caracteristica fenotípica
  (pero no significa causalidad)
• Determinación de polimorfismos que causan una
  enfermedad (dependiendo de dónde ocurre el
  cambio)

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(No Transcript)
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Inicio de Transcripción
downstream
upstream
Met-Lys-Ala- -
Inicio de Traducción
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Región promotora 5UTR
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• Secuencias repetitivas simples
• 1. DNA satélite 5-500 pb en tándem (extensiones
  en el
• orden de las megabases, 106 pb)
• Centrómero
• DNA minisatélite 5-100 pb en tándem ( 103-105
  pb)
• Conservado telómeros
• Hipervariable (longitud) cerca de
  telómeros
• ? identificación de individuos
  (fingerprint)
• 3. DNA microsatélite 1-5 pb en tándem (10-40
  pb)
• Distribuidos de manera uniforme
• Longitud variable ? relaciones
  filogenéticas

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Uso de minisatélites hipervariables en
la identificación de individuos
1. Digestión de DNA con enzimas de
restricción 2. Separación de fragmentos por
electroforesis 3. Transferencia de DNA a
membrana 4. Hibridación con sonda con
secuencia de minisatélite marcada
radioactivamente
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Análisis de polimorfismo de tamaño de cromosomas
en Leishmania

• Comparación por PFGE del tamaño de cromosomas en
  cepas y aislamientos de pacientes de diferentes
  regiones del Perú
• Variación de tamaño por amplificación
  /eliminación de genes ribosomales repetidos en
  tándem

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Polimorfismo en cromosoma que contiene los genes
ribosomales en Leishmanias del complejo Viannia.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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EJERCICIO
Usted desea determinar por PCR si un paciente es
portador del gen de la anemia falciforme. Indique
a) dónde ubicaría los primers a usarb)
cuál sería el procedimiento a seguirc)
cómo espera usted que sean los resultados