IDENTIFICACI

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IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS Litopenaeus vannamei
UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES TIPO
MICROSATÉLITES

• Ph.Dc Franklin Pérez
• Yordan Vivanco Muñoz

2

1. Utilización de los Microsatélites para la
   identificación de 32 familias de camarón
2. Análisis financiero de la utilización de la
   técnica de microsatélites para un sistema de
   producción comercial

3
IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS

• Utilización de los Microsatélites para la
  identificación de 32 familias de camarón

4
INTRODUCCIÓN
5
ACTUALES PROBLEMAS BIOLÓGICOS EN LA PRODUCCIÓN DE
CAMARÓN

• Enfermedades
• - Síndrome de Las Gaviotas (1990)
• - Síndrome de Taura (1994)
• - Síndrome de la Mancha Blanca (1999)
• Bajo crecimiento
• Endogamia

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MEJORAMIENTO GENÉTICO

• Cruzando individuos de diferente procedencia con
  mejores resultados en el campo se puede obtener
  variedades más resistentes y con mejor
  crecimiento
• Implementación el uso de marcadores moleculares
  (o genéticos) para programas de mejoramiento
  genético

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VENTAJAS DE LOS MARCADORES MOLECULARES

• Identifican el grado de parentesco entre
  individuos, evitando el cruce entre hermanos
  (endogamia)
• Su relativa fácil aplicación permite incluir
  programas de mejoramiento genético en programas
  de producción

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MARCADOR MOLECULAR

• Es un segmento de ADN con una ubicación física
  identificable en un cromosoma y cuya herencia se
  puede rastrear.

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TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES
Marcador Dominante
Marcador Codominante (Microsatélites)
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MICROSATÉLITES

• Son secuencias de bases repetitivas ej
• .TCCGTGAGTGTGTGTGT
  GTGTGTGTGTGTGGAATAT....
• .AGGCACTCACACACACACACACACACACACCTTATA.
• Abundantes en el genoma
• Presentan alta variabilidad
• Repeticiones van de 2 a 6 pares de bases con
  longitudes de 20 a 100 pb
• Pueden estar relacionadas con genes importantes
  (de resistencia y crecimiento)

11
(No Transcript)
12
VISUALIZACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES
13
AISLAMIENTO Y AMPLIFICACIÓN POR PCR DE UN
FRAGMENTO DESEADO DE DNA
CICLO 1
CICLO 2
CICLO 4
CICLO 3
14
MATERIALES Y MÉTODOS
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OBTENCIÓN DE PRIMERS

• Se diseñó a partir de secuencias publicadas en
  NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) con el programa
  Genfisher
• 1ra amplificación extracción CTAB (DNA
  purificado)
• T 42 45 48 51 54 57 60
• MgCl2 1,0 1,5 2,0 2,5
• 2da amplificación extracción CHELEX (DNA no
  purificado)

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OBTENCIÓN DE MUESTRA

• 32 familias obtenidas por el programa de
  mejoramiento PROMOGEN. 15 animales por familia

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OBTENCIÓN Y DOCUMENTACIÓN DE RESULTADOS

• PCR de las muestras
• Separación de bandas en gen de Poliacrialmida 6
• Visualización por tinción de plata
• Cámara digital Kodak DC 120
• Programa EDAS de Kodak
• El análisis del tamaño de las bandas corridas por
  electroforesis se llevó a cabo con el Programa
  GeneProfiler

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CÁLCULO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA

• Análisis de heterocigocidad observada
• Análisis de heterocigocidad esperada

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TIPO DE SEGREGACIÓN ESPERADA EN EL ANÁLISIS DE ?2
20
ANÁLISIS ENTRE FAMILIAS

• Análisis de Lineaje de familias Programa Kinship
  1.2
• Análisis Cluster (agrupamientos) Programa TFPGA
  que realiza dendogramas basados en el análisis
  UPGMA

21
RESULTADOS
22
MICROSATÉLITES ESCOGIDOS DE 131 PARES DE PRIMERS
locus Secuencia de los primers T (TD) MgCl2 (Mm) Acceso al NCBI
CN-54 F TGCTTGTGAAGGTGTGTGAACGTG R CAAGATGCGTATGCACACATTGCTG 43 1,0 AF360040
CN-67 F GAAGAGGCAGGGCGGATTT R GGAAGGGTGGGAACAAGG 51 2,0 AF360007
CN-84 F GGGTTATGATGACCAAAG R ATTGGGTCTCGGAGTTTA 59 2,0 AF360114
CN-135 F ATAATGCGAGCGTGAG R ATTCCTTAGCGAACCA 43 2,0 AF359979
CN-142 F TGCTACGCCGACAATG R GAAGGTGCTTGCGACA 43 2,0 AF360029
CN-148 F CATCATCGCTAAAATT R CCTTCTGTTGTGGGTAT 43 2,0 AF360051
CN-159 F AAGAACGAAGTGGAGGAG R AAGCACCCAGTGTAGCC 47 2,0 AF360109
23
PRESENCIA DE ALELOS NULOS
Familia 2
CN-67
CN-46
Familia 22
CN-67
CN-46
24
HETEROCIGOCIDAD
25
PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA 7 CASOS DE
SEGREGACIÓN
26
PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA 7 CASOS DE
SEGREGACIÓN
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PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA Familia que no
presenta ningún caso de segregación

CN-84, familia 23
28
PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA

• Individuo que no presenta el perfil del grupo

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AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA
KINSHIP Familia 25
Probabilidad de 95,0 que sean
hermanos Probabilidad de 99,0 que
sean hermanos Probabilidad de 99.9
que sean hermanos
30
AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA
KINSHIP Familia 24
Probabilidad de 95,0 que sean
hermanos Probabilidad de 99,0 que
sean hermanos Probabilidad de 99.9
que sean hermanos NS No significativo
31
AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP
32
AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA
KINSHIP
33
AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA
KINSHIP
34
DENDOGRAMA FAMILIAR REALIZADO CON EL PROGRAMA
TFPGA
35
DISCUSIÓN
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PRESENCIA DE ALELOS NULOS

• No hay correcto plegado de iniciador, por una
  mutación
• Modificación o cambio de primer podría amplificar
  el alelo nulo
• Puede subir la proporción de falsos homocigotos

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VARIABILIDAD GENÉTICA

• Cuando la Ho es menor que la He se debe a una
  alta consanguinidad (muchos homocigotos) o
  incidencia de alelos nulos
• Caso los loci CN-84 CN-135 CN-142 CN-148
  CN-159
• Cuando la Ho es mayor que la He se debe a un
  exceso de heterocigotos por a las cruzas
  dirigidas y no al azar
• Caso del locus CN-54

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VARIABILIDAD GENÉTICA

• La población silvestre ecuatoriana (Casalla,
  2003) tiene más variabilidad que las familias en
  estudio por tener
• Mayor número de alelos
• Mayor Heterocigocidad
• Presencia de 21 alelos en las familias que no
  tiene la población silvestre debido al origen
  distinto de algunos reproductores (Panamá)

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SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO

• En la familia 25 encontramos

Locus Segregación
CN-54 1
CN-67 1
CN-84 121
CN-135 1
CN-142 1111
CN-148 121
CN-159 121
2da ley de Mendel cada alelo tiene segregación
independiente, no depende de la segregación de
otro alelo.
40
SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO

• Se encotraron 2 grupos de familias, donde cada
  grupo presentó los mismos perfiles
• F7 y F8
• F16, F17 y F18
• Hecho que supone la división de un desove en
  algunos tanques

41
SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO

• 20 individuos específicos (distribuidos en las
  familias) no pertenecieron al perfil familiar
• El individuo F5 12 no perteneció a los perfiles
  de la familia F5 pero fue agrupado (por el
  programa Kinship) en la familia 23 indicando el
  origen de la muestra

42
SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO

• Errores y discordancia en la segregación
  mendeliana se deben principalmente a 3 razones
• Error durante la manipulación de la muestra
• Mal manejo de familias
• Por mutación (alelos nulos o alelos diferentes)

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ANÁLISIS FINANCIERO

• Análisis financiero de la utilización de la
  técnica de microsatélites para un sistema de
  producción comercial

44
SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE SELECCIÓN
FAMILIAR
45
SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE WALK BACK
SELECTION
46
(No Transcript)
47
DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS A y B

• Maduración
• 1 Galpón de maduración de 132 m2 8 tanques,
  producción de 3200.000 nauplios diarios durante
  9 meses al año
• Larvicultura
• 2 Tanques de 13 m3 c/u 6200.000 larvas anual (3
  ciclos)
• 1 Galpón para 50 recipientes de 50 L c/u
• 49 Tanques plásticos exteriores de 2 m3
• Camaronera
• 20 Has, 95.466 libras al año (3 ciclos)
• Están incluidos 1 Ha, selección de reproductores
• 0,5 Ha, crecimiento de
  reproductores
• 9.900
  reproductores al año

48
ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO A
Proyecto A 5 años con ciclos de 4 meses
49
ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO B
Proyecto B 5 años con ciclos de 4 meses
50
FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS A Y B
51
VENTAS DE LOS PROYECTOS A Y B
52
DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS C y D

• Maduración
• 1 Galpón de maduración de 132 m2 8 tanques,
  producción de 3200.000 nauplios diarios durante
  9 meses al año
• Larvicultura
• 2 Tanques 13 m3 c/u 7050.000 larvas anual (3
  ciclos)
• Camaronera
• 20 Has, 109.104 libras al año (3 ciclos)
• Incluiye 0,5 Ha, crecimiento de reproductores
• 
  7.200 reproductores al año

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ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO C
Proyecto C 5 años con ciclos de 4 meses
54
ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO D
Proyecto D 5 años con ciclos de 4 meses
55
FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS C Y D
56
VENTAS DE LOS PROYECTOS C Y D
57
DISCUSIÓNCOMPARACIÓN DE LOS 4 PROYECTOS
58
CONCLUSIONES

• CONCLUCIONES DE LA IDENTIFICACIÓN FAMILIAR
• CONCLUCIONES FINANCIERAS

59
CONCLUSION DE LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS

• Se puede utilizar microsatélites específicos para
  Litopenaeus vannamei para la determinación de
  familias y parentesco
• Se comprobó la utilidad de la técnica de
  marcadores microsatélites para el control de
  programas de mejoramiento genético en camarón

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RECOMENDACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS

• Es preferible tener la información del genotipo
  de los padres, para conocer el genotipos de la
  descendencia y determinar si hubo mala
  manipulación al encontrar individuos
  introducidos.
• Un estudio con mayor número de loci
  microsatélites, los resultados son más exactos,
  debido a la presencia de alelos nulos

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CONCLUSIONES DE LA COMPARACIÓN DE LOS 4 PROYECTOS

• Es mejor implementar el sistema de Walk Back
  Selection por su menor necesidad de inversión y
  tener los mejores índices, la mejor opción
  alquilar las instalaciones (D)
• Mientras mayor sea la cantidad de hectáreas en
  producción, el proyecto será más estable ante las
  variaciones de precios de venta y costo de
  insumos ya que es la venta que produce mayor
  ganancia.

62
GRACIAS