Title: TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
1TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Química Biológica Patológica
Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas
Tema1 (1)
? Dra. Silvia Varas svaras_at_unsl.edu.ar
2TIPO DE MUTACION
- DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR
PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR
3Espectro de diferentes tipos de mutaciones en
genes humanos (Human Gene Mutation Database)
?Mutaciones sin sentido
? Mutaciones con cambio de sentido
- 14.363 mutaciones en 783 genes
4MUTACIONES PUNTUALES
- En la región regulatoria
- En el splicing
- Sin sentido (nonsense)
- Con cambio de sentido (missense)
5Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
- Grandes Deleciones
- Southern Blotting
- PCR Multiplex
- GAP-PCR
- MLPA
- Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas
- RFLP-PCR(ER-PCR)
- Mutagenesis mediada por PCR
- Alelo-Específicas
- MAS-PCR
- ARMS- MARMS
- DOT-ASO
6Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular II
- Desconozco la mutación o polimorfismo
- SSCP
- (single strand conformation polymorphism)
- DGGE
- (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
7SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena
única)
- SSCP (single strand conformation polymorphism)
es un método simple y accesible para detectar
alteraciones en la secuencia en un fragmento
obtenido por PCR
8SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena
única)
- La técnica de SSCP detecta variaciones en la
secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros
cambios pequeños) debido a la generación de
diferencias en la movilidad electroforética. - Bajo condiciones no desnaturalizantes, las
moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas
que dependen de su secuencia de nucleótidos. - Los cambios conformacionales producidos por
variaciones en la secuencia de ADN pueden
resultar en diferencia de movilidad detectables.
9- Un par de primers específico es utilizado para
amplificar el ADN blanco. - La muestra se enriquece en ssADN por medio de una
PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de
los primers en mayor cantidad que el otro. - Las movilidades de los fragmentos simple cadena
se comparan mediante electroforesis en un gel
neutro de poliacrilamida. - Las bandas son detectadas.
Rápido enfriamiento
10DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
- Los productos de PCR son cargados en un gel con
un gradiente desnaturalizante - Típicamente 20-80 formamida
- ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting
- El melting es determinado por su secuencia y
contenido de GC - Las diferentes secuencias migran a diferentes
distancias
20
80
11(No Transcript)
12Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
- Grandes Deleciones
- Southern Blotting
- GAP-PCR
- PCR Multiplex
- MLPA
13Tipos de Blots
- Southern Blot transfiere DNA y la sonda o probe
es de ADN - Northern Blot transfiere RNA y la sonda o probe
es de ADN - Western Blot transfiere proteínas y la sonda o
probe son anticuerpos.
14(No Transcript)
15The Southern blotting technique
16(No Transcript)
17Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
- Grandes Deleciones
- Southern Blotting
- PCR Multiplex
- GAP-PCR
- MLPA
18(No Transcript)
19(No Transcript)
20- PCR Multiplex
- Es una variante de PCR en donde dos o más loci
son simultáneamente amplificados en la misma
reacción.
Cuidados especiales 1-Los primers de 18-24 pb
deben tener un contenido de GC 35-60 de esa
forma tiene una T anneling de 55-58ºC o
mayor. 2-Distribuir los amplicones de distintos
tamaños. 3-Diseñar primers con características
similares sin estructura secundaria ni
interacciones entre ellos. 4-Se debe calcular el
Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar
las interacciones entre los primers).
21Cuidados especiales II 5- Se deberá optimizar
Tº extensión, Tiempo de extensión, Tiempo y
temperatura de anneling, número de ciclos,
cantidad de primers, concentración de dNTP y
MgCl2, uso de adyuvantes (glicerol, DMSO, BSA),
etc.
22(No Transcript)
23(No Transcript)
24(No Transcript)
25Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
- Grandes Deleciones
- Southern Blotting
- PCR Multiplex
- GAP-PCR
- MLPA
26GAP-PCR.
- Se utiliza un par de primers que flanqueen la
zona delecionada (para el alelo mutado) y un
primers ubicado sobre la deleción (para el alelo
normal). - Se generará dos productos de amplificación, el
fragmento de menor tamaño se producirá a partir
del alelo que presenta la mutación. -
27Delecion African HPFH-2
M
N
28Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
- Grandes Deleciones
- Southern Blotting
- PCR Multiplex
- GAP-PCR
- MLPA
29MLPA (múltiple amplificación de sondas
dependiente de ligación)
- Es una técnica basadas en una amplificación
cuantitativa por PCR. - Presentan la ventaja de permitir el análisis de
hasta 40-50 secuencias blanco simultáneamente. - Son técnicas muy usadas para detección de
delecciones y duplicaciones del genoma. - Se aplica a estudios en genética humana,
citogenética e investigación en cáncer
30Instrumentos
- Un termociclador y un sistema de electroforesis
tipo de secuencia son requeridos para MLPA - Los resultados son obtenidos en 24 hs.
- Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un
experimento
31Mix-Probes
- MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos
- La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y
la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8)
32- Cada oligo a su vez contiene 2 partes
- El LPO contiene en su extremo 5 el F y en su
extremo 3 - La secuencia de la sonda de hibridización
izquierda (LHS). - El RPO contiene en su extremo 5 la sonda de
hibridización derecha (RHS) y el primer R en su
extremo 3
33- Las sondas hibridizan de manera inmediatamente
adyacente, de esta manera solo aquellos pares de
sondas que encuentran sus secuencias blanco
pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.
34(No Transcript)
35Protocolo típico de MLPA
36 Característica General
- La amplificación es de las sondas de MLPA, no de
las muestra de ADN. - El pattern de los picos son generadas sobre la
muestras de un paciente y una muestra de ADN de
referencia. Se compara la altura relativa de los
picos. Las diferencias reflejan los cambios en el
número de copias detectados por las probes de
MLPA. - Mas de 50 probes están presentes en una reacción
de MLPA
37VENTAJAS de MLPA
- Detección de número de copias de 40-50 secuencias
de ADN genómicos en una simple reacción, basada
en PCR - Requiere únicamente 20 ng de ADN humano (3.000
células/0,5 ml de fluido amniótico). - MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcialmente
degradadas tales como ADN extraído de tacos de
tejidos parafinados.
38PROBLEMAS de MLPA
- Costo
- Necesidad de instrumental especifico
39Deleciones
40