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TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

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... SSCP (Polimorfismos de conformaci n de cadena nica) La t cnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros cambios ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR


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TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Química Biológica Patológica
Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas
  • IV- Parte

Tema1 (1)
? Dra. Silvia Varas svaras_at_unsl.edu.ar
2
TIPO DE MUTACION
  • DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR
    PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

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Espectro de diferentes tipos de mutaciones en
genes humanos (Human Gene Mutation Database)
?Mutaciones sin sentido
? Mutaciones con cambio de sentido
  • 14.363 mutaciones en 783 genes

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MUTACIONES PUNTUALES
  • En la región regulatoria
  • En el splicing
  • Sin sentido (nonsense)
  • Con cambio de sentido (missense)

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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
  • Grandes Deleciones
  • Southern Blotting
  • PCR Multiplex
  • GAP-PCR
  • MLPA
  • Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas
  • RFLP-PCR(ER-PCR)
  • Mutagenesis mediada por PCR
  • Alelo-Específicas
  • MAS-PCR
  • ARMS- MARMS
  • DOT-ASO

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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular II
  • Desconozco la mutación o polimorfismo
  • SSCP
  • (single strand conformation polymorphism)
  • DGGE
  • (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

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SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena
única)
  • SSCP (single strand conformation polymorphism)
    es un método simple y accesible para detectar
    alteraciones en la secuencia en un fragmento
    obtenido por PCR

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SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena
única)
  • La técnica de SSCP detecta variaciones en la
    secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros
    cambios pequeños) debido a la generación de
    diferencias en la movilidad electroforética.
  • Bajo condiciones no desnaturalizantes, las
    moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas
    que dependen de su secuencia de nucleótidos.
  • Los cambios conformacionales producidos por
    variaciones en la secuencia de ADN pueden
    resultar en diferencia de movilidad detectables.

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  1. Un par de primers específico es utilizado para
    amplificar el ADN blanco.
  2. La muestra se enriquece en ssADN por medio de una
    PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de
    los primers en mayor cantidad que el otro.
  3. Las movilidades de los fragmentos simple cadena
    se comparan mediante electroforesis en un gel
    neutro de poliacrilamida.
  4. Las bandas son detectadas.

Rápido enfriamiento
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DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
  • Los productos de PCR son cargados en un gel con
    un gradiente desnaturalizante
  • Típicamente 20-80 formamida
  • ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting
  • El melting es determinado por su secuencia y
    contenido de GC
  • Las diferentes secuencias migran a diferentes
    distancias

20
80
11
(No Transcript)
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
  • Grandes Deleciones
  • Southern Blotting
  • GAP-PCR
  • PCR Multiplex
  • MLPA

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Tipos de Blots
  • Southern Blot transfiere DNA y la sonda o probe
    es de ADN
  • Northern Blot transfiere RNA y la sonda o probe
    es de ADN
  • Western Blot transfiere proteínas y la sonda o
    probe son anticuerpos.

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(No Transcript)
15
The Southern blotting technique
16
(No Transcript)
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
  • Grandes Deleciones
  • Southern Blotting
  • PCR Multiplex
  • GAP-PCR
  • MLPA

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(No Transcript)
19
(No Transcript)
20
  • PCR Multiplex
  • Es una variante de PCR en donde dos o más loci
    son simultáneamente amplificados en la misma
    reacción.

Cuidados especiales 1-Los primers de 18-24 pb
deben tener un contenido de GC 35-60 de esa
forma tiene una T anneling de 55-58ºC o
mayor. 2-Distribuir los amplicones de distintos
tamaños. 3-Diseñar primers con características
similares sin estructura secundaria ni
interacciones entre ellos. 4-Se debe calcular el
Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar
las interacciones entre los primers).
21
  • PCR Multiplex

Cuidados especiales II 5- Se deberá optimizar
Tº extensión, Tiempo de extensión, Tiempo y
temperatura de anneling, número de ciclos,
cantidad de primers, concentración de dNTP y
MgCl2, uso de adyuvantes (glicerol, DMSO, BSA),
etc.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
24
(No Transcript)
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
  • Grandes Deleciones
  • Southern Blotting
  • PCR Multiplex
  • GAP-PCR
  • MLPA

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GAP-PCR.
  • Se utiliza un par de primers que flanqueen la
    zona delecionada (para el alelo mutado) y un
    primers ubicado sobre la deleción (para el alelo
    normal).
  • Se generará dos productos de amplificación, el
    fragmento de menor tamaño se producirá a partir
    del alelo que presenta la mutación.

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Delecion African HPFH-2
M
N
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular
  • Grandes Deleciones
  • Southern Blotting
  • PCR Multiplex
  • GAP-PCR
  • MLPA

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MLPA (múltiple amplificación de sondas
dependiente de ligación)
  • Es una técnica basadas en una amplificación
    cuantitativa por PCR.
  • Presentan la ventaja de permitir el análisis de
    hasta 40-50 secuencias blanco simultáneamente.
  • Son técnicas muy usadas para detección de
    delecciones y duplicaciones del genoma.
  • Se aplica a estudios en genética humana,
    citogenética e investigación en cáncer

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Instrumentos
  • Un termociclador y un sistema de electroforesis
    tipo de secuencia son requeridos para MLPA
  • Los resultados son obtenidos en 24 hs.
  • Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un
    experimento

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Mix-Probes
  • MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos
  • La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y
    la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8)

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  • Cada oligo a su vez contiene 2 partes
  • El LPO contiene en su extremo 5 el F y en su
    extremo 3
  • La secuencia de la sonda de hibridización
    izquierda (LHS).
  • El RPO contiene en su extremo 5 la sonda de
    hibridización derecha (RHS) y el primer R en su
    extremo 3

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  • Las sondas hibridizan de manera inmediatamente
    adyacente, de esta manera solo aquellos pares de
    sondas que encuentran sus secuencias blanco
    pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.

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(No Transcript)
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Protocolo típico de MLPA
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Característica General
  • La amplificación es de las sondas de MLPA, no de
    las muestra de ADN.
  • El pattern de los picos son generadas sobre la
    muestras de un paciente y una muestra de ADN de
    referencia. Se compara la altura relativa de los
    picos. Las diferencias reflejan los cambios en el
    número de copias detectados por las probes de
    MLPA.
  • Mas de 50 probes están presentes en una reacción
    de MLPA

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VENTAJAS de MLPA
  • Detección de número de copias de 40-50 secuencias
    de ADN genómicos en una simple reacción, basada
    en PCR
  • Requiere únicamente 20 ng de ADN humano (3.000
    células/0,5 ml de fluido amniótico).
  • MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcialmente
    degradadas tales como ADN extraído de tacos de
    tejidos parafinados.

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PROBLEMAS de MLPA
  • Costo
  • Necesidad de instrumental especifico

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Deleciones
40
  • Alguna pregunta?
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