Secuenciaci

1
Secuenciación de DNA, Mutaciones y Bioinformática

• José A. Cardé, PhDLab Biol 3306-GenéticaUniversi
  dad de Puerto Rico-Aguadilla

2
Objetivos

• Luego de haber completado el ejercicio, los
  estudiantes podrán 
• 1. Mencionar los dos métodos principales de
  secuenciar DNA.
• 2. Explicar el racional del uso del
  dideoxiribonucleótido en la estrategia de
  secuenciación.
• 3. Analizar una parte de una autoradiografía de
  una reacción de secuenciación real determinar la
  secuencia de un fragmento de DNA y localizar una
  mutación
• 4. Definir los que es bioinformática
• 5. Utilizar las bases de datos para un análisis
  de bioinformática de las secuencias obtenidas y
  determinar el gen al que corresponde.

3
Trasfondo

• Una vez usted obtiene el DNA se pueden hacer
  varias cosas con el durante su análissi
• - Enzimas de restricción- mapas, clonar.
• - Southern Blot- agarosas, tamaños
• - Determinar secuencia
• Hay dos acercamientos básicos utilizados para
  análisis de secuencias de DNA
• Método químico, Maxim/Gilbert Reacciones
  químicas con las bases
• Método enzimático, Sanger replicación de
  templado con el dominio Klenow de la DNA
  polimerasa de E coli

4
Trasfondo

• Químico
• Maxam y Gilbert
• Marcar radioactivamente los fragmentos en el 5
• Degradar o romper los fragmentos química-mente en
  una de las bases
• Resultan fragmentos radioactivos que todos
  terminan donde habia una A
• Electroforesis

5
Trasfondo

• Enzimático
• Sanger/Dideoxi
• Interrumpir la extensión de una cadena
  comple-mentaria a la que se secuencia.
• Incorporación de ddNTP
• Electroforesis de fragmentos marcados tambien por
  el primer

6
Trasfondo M13

• Fago M13
• Bacteriofago de E coli
• Genoma usado de vector
• 7200 pb
• Infecta cepa de E coli JM101
• Entra al al célula por el factor de fertilidad F
• DNA SS pasa a DS
• Se expresa y se forman viriones
• Salen sin lisar

7
Trasfondo M13 Genoma

• Fago M13
• Bacteriófago de E coli
• Genoma usado de vector
• 7200 pb
• Infecta cepa de E coli JM101
• Polilinker para insertar DNA a secuenciar

8
Trasfondo M13-Estrategia

• Fago M13
• Oligonucleótido primer de 17 bases
• Complementario a flanco del polilinker
• Servira como primer
• Klenow replicará lo insertado
• Klenow dominio polimerasa 5?3 de la DNA pol 1 de
  E coli.
• Le falta dominio exonucleasa 3?5

9
Reacción de Secuenciación

• 4 reacciones
• 4 tubos con lo mismo
• Klenow
• Templado a secuenciar
• Buffer para Klenow
• Los 4 dNTPs
• 32P-ATP o primer fluore
• ddA o ddT o ddG o ddC
• En cada tubo la misma reacción se detendrá en un
  ddNTP distinto.

10
Reacción de Secuenciación

• 4 reacciones
• 4 tubos con lo mismo
• Klenow
• Templado a secuenciar
• Buffer para Klenow
• Los 4 dNTPs
• 32PATP
• ddA o ddT o ddG o ddC
• En cada tubo la misma reacción se detendrá en un
  ddNTP distinto.

11
Reacción de Secuenciación

• 4 reacciones
• 4 tubos con lo mismo
• Klenow
• Templado a secuenciar
• Buffer para Klenow
• Los 4 dNTPs
• 32PATP
• ddA o ddT o ddG o ddC
• En cada tubo, la misma reacción se detendrá en un
  ddNTP distinto.

12
Reacción de Secuenciación

• Fragmentos en nido
• Reacción G
• Cada fragmento se extendió hasta que se incorporó
  una G dideoxi
• Marcado radioactiva-mente por el 32 PATP
• Fragmentos de distintos tamaños interrumpidos por
  el ddGTP
• Así para los 4 ddNTPs

13
(No Transcript)
14
Reacción de Secuenciación

• Autoradiografía
• - muestra
• - parte radioactiva
• - emulsión fotográfica
• - reducción de Ag2
• - precipitado
• - lavados
• - bandas permanentes

15
Reacción de Secuenciación

• Lectura de la gel
• Fragmentos separados por tamaño
• De abajo hacia arriba
• Cada fragmento se detuvo en la letra de su
  reacción
• Cada fragmento es complementario a lo que se
  estaba secuenciando

16
Secuenciador/Autoradiografia
17
Resultados hipoteticos
-Las bandas oscuras son producidas por la
exposición de la película de rayos X al 32P
incorporados en los fragmentos. -La secuencia
deducida de la autoradiografía es complementaria
a la cadena de DNA contenida en el DNA SS del M13
18
Procedimiento

• Obtenga una muestra de autoradiografía y
  coloquela sobre caja de luz blanca o papel
  blanco.
• Las reacciones de secuenciacion se cargaron en el
  orden G A T C
• Comience con el analisis de la secuencia del DNA
  desde abjo hacia arriba con la banda marcada como
  A

19
Procedimiento

• Compare la secuencia deducidad con la secuencia
  WT mostrada en la figura 6 abajo.
• Identifique la localización del nucleótido
  mutante. Cual fue la mutacion? Hay mas de una
  mutación? Cual?
• Bioinformática
• 6. Usando bioinformática (Blast) su instructor lo
  ayudará a identificar de que secuencia genica su
  secuencia puede ser parte.
• 7. Usando bioinformática su instructor le
  mostrará como su puede localizar su mutacion y
  muchas otras mucho mas rápido

20
References
CSHL - DNA Learning Center, Animations
21
bioinformática

• campo de la biotecnología que se ocupa en el
  almacenamiento y la manipulación de secuencias de
  información de DNA.
• de estas se espera que se pueda obtener
  información biológica útil.
• diariamente, datos del análisis de secuencias de
  DNA son sometidos a una base de datos usando la
  internet (WWW) para identificar genes o productos
  de genes.

22
bioinformática

• Los datos de la secuenciación de DNA tiene usos
  limitado a menos que se pueda convertir en
  información biológica útil.
• Bioinformática es el componente crítico de la
  secuenciación porque se involucra en unir la
  tecnología computacional con la biotecnología.
• El uso diseminado del internet ha hecho posible
  la adquisición con relativa facilidad de
  información de distintos proyectos de genomas.

23
bioinformática

• En un análisis típico, luego de obtener la data
  de secuenciación de DNA, el biólogo molecular
  buscará similaridades de DNA usando varias bases
  de datos en el WWW.
• Esta búsqueda lo dirigirá a la identificación de
  DNA secuenciado o a identificar su relación con
  genes relacionados.
• EJ Las regiones codificantes para proteínas
  pueden ser identificadas fácilmente por la
  composición de nucleótidos.

24
bioinformática

• Así mismo las regiones no codificantes se pueden
  identificar por la interrupción debido a codones
  de terminación.
• El significado funcional de las nuevas secuencias
  de DNA seguirá en aumento y será cada vez mas
  importante según se continúe generando mas y mas
  información y generándose mas y mejores motores
  de búsqueda.

25
Procedimiento

• El propósito de este ejercicio es introducir al
  estudiante a la bioinformática.
• Para que se obtenga experiencia en la búsqueda en
  bases de datos, los estudiantes utilizaran
  servicios gratuitos ya ofrecidos por el NCBI y
  que se puede acceder a través del WWW.
• Al presente ya hay varios de estos como GenBank,
  secuencias de nucleótidos en EMBL, las
  traducciones de los CDS no redundantes de GenBank
  (secuencias de proteínas).

26
Procedimiento

• Los estudiantes pueden usar cualquiera de estas
  bases de datos así como otras disponibles en el
  internet para este ejercicio.
• Para simplificar se ilustrará el uso del NCBI.
• www.ncbi.nlm.nih.gov
• Estos ejercicios podrían involucran el uso de
  BLASTN para comparar secuencias de nucleótidos y
  BLASTP para secuencias de aminoácidos en las
  bases de datos.

27
Procedimiento

• Escoges sequence analysis y en la pagina que
  aparece bajas y escoges Basic Local Aligment
  Search Tool (BLAST).
• Al llegar a la siguiente escoges nucleotide
  blast.
• Además de este hay otras opciones pero son para
  nosotros lo que nos interesa es para secuencias
  de nucleótidos.

28
Procedimiento

• Bajo nucleotide blast, click en el standard
  nucleotide-nucleotide BLAST (blastn).
• Las otras opciones son mas complicadas para
  aplicaciones especificas. Aquí hay tres
  secciones
• enter query sequence
• choose search set
• program selection

29
Procedimiento

• Enter query sequence
• Para comenzar a entrar la secuencia escribe lo
  siguiente exactamente atgcccggccccccaggggggcagagg
  cgccgc. Puede ser minúscula o mayúsculas. Una vez
  escrita la secuencia, click en el Blast .

30
Procedimiento

• A veces el servidor esta ocupado y los resultados
  tardan, solo hay que tratar de nuevo. A
  continuación hay un ejemplo de cómo se pueden
  esperar los resultadosgt

31
Procedimiento

• Al observar el reporte del Blastn nuestra
  secuencia presenta un pareo mejor con la proteína
  efectora CD42 humana. Esta fue la que obtuvo la
  mayor puntuación.
• Revisión de las dos secuencias alineadas muestra
  que nuestra secuencia de 32 nucleótidos es
  idéntica al segmento de nucleótido de CDC42.
• Como regla general, una identidad de nucleótidos
  de mas de 21 pb entre dos muestras indica
  usualmente que las secuencias están relacionadas.
• Excepción los poli A.

32
Procedimiento
Comparar dos secuencias
33
Procedimiento
Manipular secuencias
Traduccion In silico
http//www.ebi.ac.uk/Tools/st/
http//web.expasy.org/translate/
Prototype
http//www.attotron.com/cybertory/analysis/trans.h
tm
34
Preguntas de reflexión

1. Debiéramos hacer análisis prenatales para
   enfermedades que son incurables actualmente?
2. Debiéramos hacer pruebas a nuestros hijos para
   enfermedades que se manifiestan en la adultez?
3. Se le debe informar a los individuos los
   resultados de pruebas genéticas?
4. Debieran tener las agencias de seguros la
   información sobre problemas genéticos para
   decidir sobre tus seguros?
5. Cual debe ser el rol del gobierno al establecer
   las guías para pruebas genéticas en humanos?
6. Se debieran permitir los experimentos con tejidos
   fetales humanos?

35
Referencias

• Alberts, et, al., (2014). Essential Cell Biology,
  3rd Ed, Garland Science Publishing. New York.
• Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis
  Principles. (Quinta Edición). New York,
  McGraw-Hill Companies, Inc.
• NCBI National Center for Biotechnology
  Information
•  
• CSHL Cold Spring Harbor Laboratory Animations