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Tema 14.

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Tema 14. Taxonom a molecular Pulsed field gel electrophoresis PFGE ADN cromosomal obtenido por PFGE de cepas de Z. mobilis digeridas con NotI (a) y SfiI (b). – PowerPoint PPT presentation

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Title: Tema 14.


1
Tema 14.
  • Taxonomía molecular

2
  • Filogenia molecular basada en marcadores
    moleculares el ADNr procariota, 16S, 23S el
    ADNr eucariótico 18S, 28S y 5,8. Métodos de
    fingerprinting ITS, RAPD, ARDRA, BOX, REP, ERIC,
    ribotyping, ADN mitocondrial. Métodos de estudios
    basados en el ADN de comunidades microbianas
    FISH, DGGE, T-RFLP. Bioinformática. Concepto e
    Importancia. Bases de datos en Internet NCBI,
    EMBL. Software (DNAman, MEGA 4, Treeview) y
    Programas on line para análisis de secuencias
    Workbench Biology, Eztaxon Server, Ribosome
    DataBase Project, NCBI. Algoritmos de
    comparación BLAST. Construcción de Árboles
    Filogenéticos.

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  • La taxonomía estudia los principios de
    clasificación de los organismos según las
    semejanzas y diferencias de sus caracteres.
  • La sistemática trata de los resultados que se
    obtienen al aplicar tales principios

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  • Las unidades sistemáticas de cualquier categoría
    se designan con el nombre de taxones o estirpes
  • Las especies que poseen una serie de caracteres
    comunes se agrupan en Géneros, éstos de forma
    análoga en Familias
  • Órdenes,
  • Clases
  • Divisiones.

5
  • Dentro de las especies suelen distinguirse
    Subespecies, Variedades, Líneas y Clones o Cepas.
  • Población de células genéticamente idénticas,
    procedentes de una sola

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  • Tradicionalmente hemos visto la biodiversidad
    relativa a nuestra escala de conocimiento.
    Nuestra especie es una dentro de 12.500.000 que
    ahora existe y muchos que existieron en el
    pasado.
  • Estas especies se han desarrollado durante un
    periodo de 3.800.000.000 años. Durante la mayor
    parte de este tiempo las formas han existido las
    formas microbianas.

7
  • De los 3 dominios de la vida, 2 son
    exclusivamente procariotas, pero ellos contienen
    solamente alrededor de 5000 especies conocidas.
  • Muchas mas especies microbianas son conocidas
    entre los eucariotas, pero aun muchas menos que
    el número de especies animales

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  • Mucha de la biodiversidad no es vista por
    nosotros y fue totalmente desconocida hasta antes
    de la invención del microscopio por Van
    Leeuwenhoek en el siglo XVII.
  • De acuerdo con la tradición, todas las cosas
    vivas fueron ubicadas en reinos animal y reino
    vegetal.
  • Cuando los microbios aparecieron, fueron puestas
    dentro de este sistema bacterias, hongos y algas
    como las plantas y protozoos como animales.
  • Llegaron cambios necesarios para acomodar las
    diferencias fundamentales tales como las células
    eucariotas y procariotas.

9
  • Los Macro-organismos se desarrollaron a partir de
    los microbios y fueron capaces de extender la
    vida regiones desérticas de la tierra, creando
    los nuevos hábitat para los microbios en el
    proceso.
  • Esto fue relativamente reciente en la evolución.

10
  • Relativamente poco de la diversidad microbiana
    existente es conocido por el hombre.
  • Esto significa que hay un potencial enorme para
    encontrar los nuevos recursos para la
    biotecnología.

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  • Echemos una ojeada breve algunos de los grupos
    microbianos que se conocen en la actualidad
  • La diversidad de los organismos vivos es tan
    grande que no hay definición simple de especie
    aplicable a todos los grupos.
  • Esto hace que sea imposible hacer una comparación
    significativa de diversidad entre diferentes
    grupos.

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Definición taxonómica de las especies
  • En microbiología - especialmente en bacterias y
    levaduras grupos genéticamente aislados de
    organismos altamente similares (los criterios son
    descendiente fértil del acoplamiento, como en la
    especie biológica, o la semejanza del genoma en
    más del 70 basada en hibridaciones cuantitativas
    in vitro de ADNn/ADNn, o la alta semejanza en
    base a secuencias de ciertas regiones homólogas
    del ADN).

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  • La especie biológica - sobre todo desarrollada
    por los zoologistas Dobzhansky 1937 " las
    especies son sistemas de poblaciones el
    intercambio de genes entre estos sistemas esta
    limitado o prevenido por un mecanismo de
    aislamiento reproductivo o quizás por una
    combinación variada de dichos mecanismos."

14
  • Las especies filogenéticas - un grupo
    monofilogenético integrado por el conjunto
    diagnosticable más pequeño de organismos
    individuales dentro de los cuales hay un patrón
    parental de la ascendencia y de descendencia.
    (Cracraft, 1983).

15
Estimaciones del número de especie descripta y de
especie posible de microorganismos no
descriptas.(World Conservation Monitoring
Center, 1992, Global Biodiversity,D. L.
Hawksworth and R. R. Colwell)
16
Grupo Especies Descriptas Especies estimadas
Con. Algas 40.000 350.000
11.0 Bacterias 4.000 3.000.000
0,1 (incluye no cultivables) Hongos 70.000
1.500.000 5,0 Protozoarios 40.000
100.000 40.0 Virus 5.000 500.000
1.0 (incluye plásmidos, fagos etc.) Total
159.000 5.450.000 3.0
17
  • La verdadera dimensión de la diversidad
    microbiana fue reconocida recién en las pasadas
    décadas con el desarrollo de métodos genéticos
    molecular.

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  • Cronómetros evolutivos
  • Macromoléculas celulares que ayudan a medir
    cambios evolutivos
  • De Distribución universal
  • Funcionalidad homólogo
  • Alineación apropiada de las secuencias
  • Índice de cambios lento
  • Secuencias de Citocromos Ferredoxinas
    Otras proteínas (ATPasas, RecA) ARNs

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  • El ARN Ribosomal como cronómetro evolutivo
  • Moléculas antiguas
  • Funcionalmente constante
  • Distribuido universalmente
  • Moderado secuencias conservadas
  • Gran número de secuencias disponibles

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  • Huella dactilar molecular
  • ARDRA
  • RFLP by PFGE
  • RAPD
  • ITS
  • t-DNA
  • Secuenciado de ARNr
  • Perfil Plasmídico
  • SSCP
  • Huella dactilar para comunidad
  • FISH
  • DGGE
  • T-RFLP
  • Real time-PCR

21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
rRNA operon of Prokaryotes
  • 5S rRNA (120 nucleótidos)
  • 16S rRNA (1500 nucleótidos)
  • 23S rRNA (2900 nucleótidos)

24
Operon ARNr
25
(No Transcript)
26
(No Transcript)
27
Operon ARNr de Eucariotas
  • 5.8S ARNr
  • 18S ARNr
  • 28S ARNr

28
Árbol filogenético
  • Distancia distancia evolutiva, basada en las
    diferencias
  • Parsimonia (Parsimony) mínimos cambios en la
    líneas de un ancestro común

29
  • Filogenia tentativa de los eucariotas basado en
    la secuencia ribosomal y comparaciones (Perry
    Staley 1997)

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Biodiversidad
Métodos Convencionales
Métodos Moleculares
Extracción de ADN total
Screening, enriquecimiento aislamiento
Evolución Directa
Librerías de Colección
Identificación y caracterización
Cultivos puros
Screening, enriquecimiento aislamiento
Expresión de la/las enzimas de interés
Evaluación de los procesos
Librerías metabólicas
Optimización de producción
Transferencia
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Secuencia de ADNr de un cultivo de microorganismo
puro
BACTERIA
ADN AISLADO
5
Cebadores universales para PCR
Gel de agarosa
Tamaño correcto Banda simple
Secuenciado
Análisis de la secuencia
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Cultivos no individiuales
Comunidades microbianas
Microorganismo aislado
ADN AISLADO
5
Clonado Cebadores específicos para
PCR Secuenciado Análisis de las secuencias
T-RFLP DGGE FISH Real-time PCR
33
(No Transcript)
34
Pulsed field gel electrophoresis PFGE
ADN cromosomal obtenido por PFGE de cepas de Z.
mobilis digeridas con NotI (a) y SfiI (b). Lanes
M, Mid. Range I Molecular Weight PFGE Marker 1,
PROIMI A1 2, ATCC 10988T 3, ATCC 29191 4, ATCC
29192T.Migration conditions 3 V cm-1, 9 s, 40 h.
35
RAPDRandom Amplification of Polymorphic DNA
RAPD analysis of Z. mobilis strains. Lanes M1,
Molecular Weight Marker 100 bp DNA Ladder M2, 1
kb DNA Step Ladder 1, PROIMI A1 2, ATCC 10988T
3, ATCC 29191 4, ATCC 29192T. Primers used (a)
UBC4 (b) B6 (c) B7 (d) B9 (e) A8.
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SSCP Single-Strand Conformation Polymorphism
  • SSCP is the electrophoretic separation of
    single-stranded nucleic acids based on subtle
    differences in sequence (often a single base
    pair) which results in a different secondary
    structure and a measurable difference in mobility
    through a gel.

37
  • El proceso usado durante el desarrollo de SSCP
    fue el siguiente
  • Digestión del ADN total con enzimas de
    rectricción
  • Desnaturalización en solución alcalina
  • Electroforesis sobre gel de poliacrilamida neutro
  • Transferencia a una membrana de nylon
  • Hibridización con otro fragmento de ADN o mas
    claro empleando copias de ARN sintetizadas sobre
    cada cadena usadas como sondas (Orita et al.,
    1989).

38
DGGE (Denaturing Gradient GelElectrophoresis)
39
(No Transcript)
40
Aplicaciones de la técnica de DGGE.
41
  • Estudiar diversidad de microorganismos
    ambientales en una comunidad compleja (16S rDNA)
    o diversidad de genes catabólicos.
  • Estudiar las poblaciones con actividad metabólica
    o genes activos por análisis de productos de
    RT-PCR
  • Estudiar la distribución espacial y temporal de
    poblaciones bacterianas
  • Monitoreo en el tiempo
  • Analizar como varía la composición de las
    poblaciones frente a cambios ambientales
    (contaminación, clima, perturbación)

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  • Buscar microorganismos indicadores y
    específicos
  • Monitorear la liberación de microorganismos
    genéticamente modificados
  • Screening de mutaciones en genes específicos
    diagnóstico de
  • enfermedades

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  • Ventajas
  • - La secuenciación individual de bandas puede
    revelar información filogenética ? se evita la
    clonación y la selección previa secuenciación
  • - Análisis de hibridación de los perfiles con
    sondas específicas de grupo (Agrobacterium
    tumefasciens)
  • - Se pueden correr simultáneamente fragmentos
    patrones correspondientes a grupos o especies
    específicas ?
  • identificación directa
  • - El bandeo complejo puede reducirse usando
    primers específicos de grupo (cyanobacterias,
    agrobacteria, actinomycetes)

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  • Ventajas
  • Amplificar fragmentos de genes funcionales
    presentes en grupos particulares de bacterias
    (NiFe hidrogenasas en Desulfovibrio)
  • Análisis simultáneo de gran cantidad de
    muestras en poco tiempo (2 geles simultáneos con
    30 calles c/u en 3 hs)
  • Se pueden identificar las bandas si se corren
    simultáneamente patrones específicos

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  • Desventajas
  • No se pueden correr más de 500 pb
  • Existen diferencias gel a gel, pero las
    posiciones relativas de las bandas permanecen
    estables
  • Hasta que una banda en el gel es verificada, la
    sola posición en el gradiente no tiene
    significado
  • No es posible separar fragmentos de DNA con
    cierta cantidad de variación de secuencia

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  • Desventajas
  • Se pueden observar bandas dobles como
    resultado de la presencia de bases balanceantes
    en primers degenerados solamente muestra los
    fragmentos de DNA de las especies predominantes
    de la comunidad (se estima que las bacterias que
    estén en proporción superior al 1)
  • La microheterogeneidad de secuencias y la
    presencia de múltiples operones pueden llevar a
    una sobrestimación del nº de bacterias de una
    comunidad.

47
  • Limitaciones de la técnica
  • 1. Manipuleo en la toma de la muestra
    condiciones de muestreo y mantenimiento de la
    muestra
  • 2. Extracción de ácidos nucleicos lisis
    reproducible de todas las bacterias, remoción de
    sustancias que inhiben la reacción de PCR (ács.
    húmicos, exopolisacáridos)
  • 3. Reacción de PCR
  • - Amplificación diferencial o preferencial (por
    renaturalización del templado)
  • - Formación de heterodúplex (renaturalización de
    productos de PCR)

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  • Conclusiones
  • ? DGGE ofrece una rápida detección de las
    poblaciones predominantes
  • AMPLIFICABLES.
  • ? Detecta rápidamente diferencias en las
    secuencias de fragmentos de genes homólogos
    amplificados por PCR.

49
Diferentes etapas para el análisis de comunidades
microbianas con el DGGE
50
Terminal-restrictionfragment lengthpolymorphism
(T-RFLP)
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
(TRFLP or sometimes T-RFLP) is a molecular
biology technique for profiling of microbial
communities based on the position of a
restriction site closest to a labeled end of an
amplified gene. The method is based on digesting
a mixture of PCR amplified variants of a single
gene using one or more restriction enzymes and
detecting the size of each of the individual
resulting terminal fragments using a DNA
sequencer
51
Por que nos enfocamos en el ARNr
  • RNA content/cell
  • 80 del ARN celular es ARNr
  • 15 del ARN celular es ARNt
  • 5 del ARN celular es ARNm

52
Aspecto microbiano de la biodiversidad
  • Es imposible de cuantificar la abundancia de un
    organismo no cultivable
  • La posibilidad para realizar genómica ambiental
    abre una perspectiva para determinar el potencial
    fisiológico de microorganismos no cultivables

53
Precauciones
  • Saber que la heterogeneidad del gen ARNr debe ser
    por arriba del 5-6 de la secuencia disimilar
    (Haloarcula, Thermobispora)
  • El estudio apropiado debe contribuir con un buena
    calidad de secuencia de ARNr (p.e. evitando
    artefacto de PCR) debe ser conducido por una
    muestra bien documentada desde los sitios
    característicos, preferentemente acompañado por
    cultivos y experimentos de hibridización

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Por que buscar la diversidad microbiana
  • Estrategias y limites de vida
  • El rol de los microorganismos en los ciclos
    biogeoquímicos
  • Una fuente de biotecnología
  • Para el monitoreo de cambios medioambientales
  • Para la protección de los organismos superiores
  • Para el entendimiento de la ecología y los
    principios de evolución

55
Cómo determinar diversidad microbiana
  • Análisis de secuencias randomizadas inserto en
    los clones
  • Hibridización con sondas taxón específicas
  • RFLP
  • ARDRA
  • DGGE
  • TGGE
  • T-RFLP

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Terminal-restriction fragment lengthpolymorphism
(T-RFLP)
  • Técnicas de cultivos independientes para el
    seguimiento de comunidades microbianas
  • Basado en amplificació por PCR de marcadores
    genéticos de ARNr 16s
  • Aspectos a considerar 1) limites de detección,
    2)
  • reproducibilidad, 3) cuestiones biológica para
    tratar diversidad total
  • Miembros predominantes
  • Dinámica de la población, etc

57
Cebadores marcados fluorescentemente
  • Pares de cebadores universales FAM63F and
    HEX1389R (numerados por E. coli)
  • De acuerdo al sistema de seguimiento, el mas
    usado para estudios ecológicos
  • Regiones mas amplificadas del gene ARN16s

58
Protocolo para T-RFLP
  • 1. Extracción del ADN de la comunidad o muestras
    de ARN medioambientales
  • 2. Amplificación por PCR del gen ARNr 16s con
    cebadores fluorescentes
  • 3. Digestión con enzimas de restricción (ej.
    CfoI, AluI)
  • 4. Detección y determinación del tamaño de los
    fragmentos terminales marcados por electroforesis
    capilar o en gel
  • CfoI profile

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Perfil del T-RFLP
  • Electroferograma
  • Diferentes fragmentos provienen de diferentes
    organismos
  • Diversos organismos pueden compartir un tamaño
    común de fragmento terminal
  • La Altura de pico en principio correlacionado a
    la abundancia del grupo de organismos (?)

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Los Pro y contra de T-RFLP
  • LIMITACIONES
  • Predispocisión inherente a los fundamentos
    técnicos de PCR
  • Datos generados dependientes de la elección de
    enzima de restricción
  • Un grupo grande de organismos puede compartir el
    mismo tamaño terminal del fragmento
  • El tamaño evidente puede diferenciar de tamaño
    real y varía con el tipo de análisis genéticos
  • VENTAJAS
  • Técnica directa
  • Alta reproducibilidad en cada paso del proceso
  • altamente Preciso (si no siempre exacto)
  • Los datos pueden ser objetivamente procesados
    digitalmente
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