Title: Tema 14.
1Tema 14.
2- Filogenia molecular basada en marcadores
moleculares el ADNr procariota, 16S, 23S el
ADNr eucariótico 18S, 28S y 5,8. Métodos de
fingerprinting ITS, RAPD, ARDRA, BOX, REP, ERIC,
ribotyping, ADN mitocondrial. Métodos de estudios
basados en el ADN de comunidades microbianas
FISH, DGGE, T-RFLP. Bioinformática. Concepto e
Importancia. Bases de datos en Internet NCBI,
EMBL. Software (DNAman, MEGA 4, Treeview) y
Programas on line para análisis de secuencias
Workbench Biology, Eztaxon Server, Ribosome
DataBase Project, NCBI. Algoritmos de
comparación BLAST. Construcción de Árboles
Filogenéticos.
3- La taxonomía estudia los principios de
clasificación de los organismos según las
semejanzas y diferencias de sus caracteres. - La sistemática trata de los resultados que se
obtienen al aplicar tales principios
4- Las unidades sistemáticas de cualquier categoría
se designan con el nombre de taxones o estirpes - Las especies que poseen una serie de caracteres
comunes se agrupan en Géneros, éstos de forma
análoga en Familias - Órdenes,
- Clases
- Divisiones.
5- Dentro de las especies suelen distinguirse
Subespecies, Variedades, Líneas y Clones o Cepas.
- Población de células genéticamente idénticas,
procedentes de una sola
6- Tradicionalmente hemos visto la biodiversidad
relativa a nuestra escala de conocimiento.
Nuestra especie es una dentro de 12.500.000 que
ahora existe y muchos que existieron en el
pasado. - Estas especies se han desarrollado durante un
periodo de 3.800.000.000 años. Durante la mayor
parte de este tiempo las formas han existido las
formas microbianas.
7- De los 3 dominios de la vida, 2 son
exclusivamente procariotas, pero ellos contienen
solamente alrededor de 5000 especies conocidas. - Muchas mas especies microbianas son conocidas
entre los eucariotas, pero aun muchas menos que
el número de especies animales
8- Mucha de la biodiversidad no es vista por
nosotros y fue totalmente desconocida hasta antes
de la invención del microscopio por Van
Leeuwenhoek en el siglo XVII. - De acuerdo con la tradición, todas las cosas
vivas fueron ubicadas en reinos animal y reino
vegetal. - Cuando los microbios aparecieron, fueron puestas
dentro de este sistema bacterias, hongos y algas
como las plantas y protozoos como animales. - Llegaron cambios necesarios para acomodar las
diferencias fundamentales tales como las células
eucariotas y procariotas.
9- Los Macro-organismos se desarrollaron a partir de
los microbios y fueron capaces de extender la
vida regiones desérticas de la tierra, creando
los nuevos hábitat para los microbios en el
proceso. - Esto fue relativamente reciente en la evolución.
10- Relativamente poco de la diversidad microbiana
existente es conocido por el hombre. - Esto significa que hay un potencial enorme para
encontrar los nuevos recursos para la
biotecnología.
11- Echemos una ojeada breve algunos de los grupos
microbianos que se conocen en la actualidad - La diversidad de los organismos vivos es tan
grande que no hay definición simple de especie
aplicable a todos los grupos. - Esto hace que sea imposible hacer una comparación
significativa de diversidad entre diferentes
grupos.
12Definición taxonómica de las especies
- En microbiología - especialmente en bacterias y
levaduras grupos genéticamente aislados de
organismos altamente similares (los criterios son
descendiente fértil del acoplamiento, como en la
especie biológica, o la semejanza del genoma en
más del 70 basada en hibridaciones cuantitativas
in vitro de ADNn/ADNn, o la alta semejanza en
base a secuencias de ciertas regiones homólogas
del ADN).
13- La especie biológica - sobre todo desarrollada
por los zoologistas Dobzhansky 1937 " las
especies son sistemas de poblaciones el
intercambio de genes entre estos sistemas esta
limitado o prevenido por un mecanismo de
aislamiento reproductivo o quizás por una
combinación variada de dichos mecanismos."
14- Las especies filogenéticas - un grupo
monofilogenético integrado por el conjunto
diagnosticable más pequeño de organismos
individuales dentro de los cuales hay un patrón
parental de la ascendencia y de descendencia.
(Cracraft, 1983).
15Estimaciones del número de especie descripta y de
especie posible de microorganismos no
descriptas.(World Conservation Monitoring
Center, 1992, Global Biodiversity,D. L.
Hawksworth and R. R. Colwell)
16Grupo Especies Descriptas Especies estimadas
Con. Algas 40.000 350.000
11.0 Bacterias 4.000 3.000.000
0,1 (incluye no cultivables) Hongos 70.000
1.500.000 5,0 Protozoarios 40.000
100.000 40.0 Virus 5.000 500.000
1.0 (incluye plásmidos, fagos etc.) Total
159.000 5.450.000 3.0
17- La verdadera dimensión de la diversidad
microbiana fue reconocida recién en las pasadas
décadas con el desarrollo de métodos genéticos
molecular.
18- Cronómetros evolutivos
- Macromoléculas celulares que ayudan a medir
cambios evolutivos - De Distribución universal
- Funcionalidad homólogo
- Alineación apropiada de las secuencias
- Índice de cambios lento
- Secuencias de Citocromos Ferredoxinas
Otras proteínas (ATPasas, RecA) ARNs
19- El ARN Ribosomal como cronómetro evolutivo
- Moléculas antiguas
- Funcionalmente constante
- Distribuido universalmente
- Moderado secuencias conservadas
- Gran número de secuencias disponibles
20- Huella dactilar molecular
- ARDRA
- RFLP by PFGE
- RAPD
- ITS
- t-DNA
- Secuenciado de ARNr
- Perfil Plasmídico
- SSCP
- Huella dactilar para comunidad
- FISH
- DGGE
- T-RFLP
- Real time-PCR
21(No Transcript)
22(No Transcript)
23rRNA operon of Prokaryotes
- 5S rRNA (120 nucleótidos)
- 16S rRNA (1500 nucleótidos)
- 23S rRNA (2900 nucleótidos)
24Operon ARNr
25(No Transcript)
26(No Transcript)
27Operon ARNr de Eucariotas
- 5.8S ARNr
- 18S ARNr
- 28S ARNr
28Árbol filogenético
- Distancia distancia evolutiva, basada en las
diferencias - Parsimonia (Parsimony) mínimos cambios en la
líneas de un ancestro común
29- Filogenia tentativa de los eucariotas basado en
la secuencia ribosomal y comparaciones (Perry
Staley 1997)
30Biodiversidad
Métodos Convencionales
Métodos Moleculares
Extracción de ADN total
Screening, enriquecimiento aislamiento
Evolución Directa
Librerías de Colección
Identificación y caracterización
Cultivos puros
Screening, enriquecimiento aislamiento
Expresión de la/las enzimas de interés
Evaluación de los procesos
Librerías metabólicas
Optimización de producción
Transferencia
31Secuencia de ADNr de un cultivo de microorganismo
puro
BACTERIA
ADN AISLADO
5
Cebadores universales para PCR
Gel de agarosa
Tamaño correcto Banda simple
Secuenciado
Análisis de la secuencia
32Cultivos no individiuales
Comunidades microbianas
Microorganismo aislado
ADN AISLADO
5
Clonado Cebadores específicos para
PCR Secuenciado Análisis de las secuencias
T-RFLP DGGE FISH Real-time PCR
33(No Transcript)
34Pulsed field gel electrophoresis PFGE
ADN cromosomal obtenido por PFGE de cepas de Z.
mobilis digeridas con NotI (a) y SfiI (b). Lanes
M, Mid. Range I Molecular Weight PFGE Marker 1,
PROIMI A1 2, ATCC 10988T 3, ATCC 29191 4, ATCC
29192T.Migration conditions 3 V cm-1, 9 s, 40 h.
35RAPDRandom Amplification of Polymorphic DNA
RAPD analysis of Z. mobilis strains. Lanes M1,
Molecular Weight Marker 100 bp DNA Ladder M2, 1
kb DNA Step Ladder 1, PROIMI A1 2, ATCC 10988T
3, ATCC 29191 4, ATCC 29192T. Primers used (a)
UBC4 (b) B6 (c) B7 (d) B9 (e) A8.
36SSCP Single-Strand Conformation Polymorphism
- SSCP is the electrophoretic separation of
single-stranded nucleic acids based on subtle
differences in sequence (often a single base
pair) which results in a different secondary
structure and a measurable difference in mobility
through a gel.
37- El proceso usado durante el desarrollo de SSCP
fue el siguiente - Digestión del ADN total con enzimas de
rectricción - Desnaturalización en solución alcalina
- Electroforesis sobre gel de poliacrilamida neutro
- Transferencia a una membrana de nylon
- Hibridización con otro fragmento de ADN o mas
claro empleando copias de ARN sintetizadas sobre
cada cadena usadas como sondas (Orita et al.,
1989).
38DGGE (Denaturing Gradient GelElectrophoresis)
39(No Transcript)
40Aplicaciones de la técnica de DGGE.
41- Estudiar diversidad de microorganismos
ambientales en una comunidad compleja (16S rDNA)
o diversidad de genes catabólicos. - Estudiar las poblaciones con actividad metabólica
o genes activos por análisis de productos de
RT-PCR - Estudiar la distribución espacial y temporal de
poblaciones bacterianas - Monitoreo en el tiempo
- Analizar como varía la composición de las
poblaciones frente a cambios ambientales
(contaminación, clima, perturbación)
42- Buscar microorganismos indicadores y
específicos - Monitorear la liberación de microorganismos
genéticamente modificados - Screening de mutaciones en genes específicos
diagnóstico de - enfermedades
43- Ventajas
- - La secuenciación individual de bandas puede
revelar información filogenética ? se evita la
clonación y la selección previa secuenciación - - Análisis de hibridación de los perfiles con
sondas específicas de grupo (Agrobacterium
tumefasciens) - - Se pueden correr simultáneamente fragmentos
patrones correspondientes a grupos o especies
específicas ? - identificación directa
- - El bandeo complejo puede reducirse usando
primers específicos de grupo (cyanobacterias,
agrobacteria, actinomycetes)
44- Ventajas
- Amplificar fragmentos de genes funcionales
presentes en grupos particulares de bacterias
(NiFe hidrogenasas en Desulfovibrio) - Análisis simultáneo de gran cantidad de
muestras en poco tiempo (2 geles simultáneos con
30 calles c/u en 3 hs) - Se pueden identificar las bandas si se corren
simultáneamente patrones específicos
45- Desventajas
- No se pueden correr más de 500 pb
- Existen diferencias gel a gel, pero las
posiciones relativas de las bandas permanecen
estables - Hasta que una banda en el gel es verificada, la
sola posición en el gradiente no tiene
significado - No es posible separar fragmentos de DNA con
cierta cantidad de variación de secuencia
46- Desventajas
- Se pueden observar bandas dobles como
resultado de la presencia de bases balanceantes
en primers degenerados solamente muestra los
fragmentos de DNA de las especies predominantes
de la comunidad (se estima que las bacterias que
estén en proporción superior al 1) - La microheterogeneidad de secuencias y la
presencia de múltiples operones pueden llevar a
una sobrestimación del nº de bacterias de una
comunidad.
47- Limitaciones de la técnica
- 1. Manipuleo en la toma de la muestra
condiciones de muestreo y mantenimiento de la
muestra - 2. Extracción de ácidos nucleicos lisis
reproducible de todas las bacterias, remoción de
sustancias que inhiben la reacción de PCR (ács.
húmicos, exopolisacáridos) - 3. Reacción de PCR
- - Amplificación diferencial o preferencial (por
renaturalización del templado) - - Formación de heterodúplex (renaturalización de
productos de PCR)
48- Conclusiones
- ? DGGE ofrece una rápida detección de las
poblaciones predominantes - AMPLIFICABLES.
- ? Detecta rápidamente diferencias en las
secuencias de fragmentos de genes homólogos
amplificados por PCR.
49Diferentes etapas para el análisis de comunidades
microbianas con el DGGE
50Terminal-restrictionfragment lengthpolymorphism
(T-RFLP)
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
(TRFLP or sometimes T-RFLP) is a molecular
biology technique for profiling of microbial
communities based on the position of a
restriction site closest to a labeled end of an
amplified gene. The method is based on digesting
a mixture of PCR amplified variants of a single
gene using one or more restriction enzymes and
detecting the size of each of the individual
resulting terminal fragments using a DNA
sequencer
51Por que nos enfocamos en el ARNr
- RNA content/cell
- 80 del ARN celular es ARNr
- 15 del ARN celular es ARNt
- 5 del ARN celular es ARNm
52Aspecto microbiano de la biodiversidad
- Es imposible de cuantificar la abundancia de un
organismo no cultivable - La posibilidad para realizar genómica ambiental
abre una perspectiva para determinar el potencial
fisiológico de microorganismos no cultivables
53Precauciones
- Saber que la heterogeneidad del gen ARNr debe ser
por arriba del 5-6 de la secuencia disimilar
(Haloarcula, Thermobispora) - El estudio apropiado debe contribuir con un buena
calidad de secuencia de ARNr (p.e. evitando
artefacto de PCR) debe ser conducido por una
muestra bien documentada desde los sitios
característicos, preferentemente acompañado por
cultivos y experimentos de hibridización
54Por que buscar la diversidad microbiana
- Estrategias y limites de vida
- El rol de los microorganismos en los ciclos
biogeoquímicos - Una fuente de biotecnología
- Para el monitoreo de cambios medioambientales
- Para la protección de los organismos superiores
- Para el entendimiento de la ecología y los
principios de evolución
55Cómo determinar diversidad microbiana
- Análisis de secuencias randomizadas inserto en
los clones - Hibridización con sondas taxón específicas
- RFLP
- ARDRA
- DGGE
- TGGE
- T-RFLP
56Terminal-restriction fragment lengthpolymorphism
(T-RFLP)
- Técnicas de cultivos independientes para el
seguimiento de comunidades microbianas - Basado en amplificació por PCR de marcadores
genéticos de ARNr 16s - Aspectos a considerar 1) limites de detección,
2) - reproducibilidad, 3) cuestiones biológica para
tratar diversidad total - Miembros predominantes
- Dinámica de la población, etc
57Cebadores marcados fluorescentemente
- Pares de cebadores universales FAM63F and
HEX1389R (numerados por E. coli) - De acuerdo al sistema de seguimiento, el mas
usado para estudios ecológicos - Regiones mas amplificadas del gene ARN16s
58Protocolo para T-RFLP
- 1. Extracción del ADN de la comunidad o muestras
de ARN medioambientales - 2. Amplificación por PCR del gen ARNr 16s con
cebadores fluorescentes - 3. Digestión con enzimas de restricción (ej.
CfoI, AluI) - 4. Detección y determinación del tamaño de los
fragmentos terminales marcados por electroforesis
capilar o en gel - CfoI profile
59Perfil del T-RFLP
- Electroferograma
- Diferentes fragmentos provienen de diferentes
organismos - Diversos organismos pueden compartir un tamaño
común de fragmento terminal - La Altura de pico en principio correlacionado a
la abundancia del grupo de organismos (?)
60Los Pro y contra de T-RFLP
- LIMITACIONES
- Predispocisión inherente a los fundamentos
técnicos de PCR - Datos generados dependientes de la elección de
enzima de restricción - Un grupo grande de organismos puede compartir el
mismo tamaño terminal del fragmento - El tamaño evidente puede diferenciar de tamaño
real y varía con el tipo de análisis genéticos - VENTAJAS
- Técnica directa
- Alta reproducibilidad en cada paso del proceso
- altamente Preciso (si no siempre exacto)
- Los datos pueden ser objetivamente procesados
digitalmente