Sin t

1
Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.
María Lilia Díaz Betancourt1, Liz Betty García1,
Ernesto León Rodríguez F2, Julio César Klinger1,
Miryam Bravo de Insuasty1
1 Laboratorio de Inmunología e
Infecciosas http//orbita.starmedia.com/diseases
Email diseases_at_starmedia.com ó
mldiaz_at_emtel.net.co 2 Laboratorio de
Bioantropología http//200.21.83.171/antropos Emai
l antropos_at_ucauca.edu.co Universidad del Cauca
Popayán, Colombia
Palabras claves PCR, Mycobacterium
tuberculosis, tuberculosis, biopsias frescas,
biopsias parafinadas,
2
Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.
INTRODUCCIÓN... La tuberculosis es la primera
causa mundial de muerte por enfermedad
infecciosa. El 30 de las población mundial
está infectada. En el mundo se enferman
9.000.000 y se mueren 3.000.000 de personas cada
año por causa de la tuberculosis. Uno de los
problemas que aún existe a pesar de más de 100
años de conocerse el bacilo causante de la
tuberculosis, es la baja sensibilidad de los
métodos de diagnóstico disponibles.
3
Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.
INTRODUCCIÓN... Así la tinción para bacilos
ácido-alcohol resistentes (ZN) requiere de 10.000
micobacterias/ml de muestra para ser positivo y
en nuestros tiempos con el creciente número de
pacientes inmunodeficientes es inespecífico El
cultivo requiere 400 micobacterias/ml de muestra
y es necesario esperar mínimo tres semanas y
hasta 2 meses para obtener el aislamiento.
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Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.
INTRODUCCIÓN... La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es una metodología de Biología
molecular. Es una técnica que puede ser aplicada
en la identificación de micobacterias, es rápida
y más sensible que el cultivo. Consiste en
replicar in vitro una secuencia conocida de ADN
característica de una determinada célula en este
caso solamente presente en micobacterias del
Complejo Mycobacterium tuberculosis de tal manera
que al final del procedimiento se obtienen
millones de cadenas, visibles fácilmente por
diversas metodologías, a partir de unas pocas
cadenas que pudieran estar en una muestra clínica.
5
Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.

• OBJETIVOS...
• Estandarizar y aplicar una prueba de PCR
  al diagnóstico de tuberculosis en biopsias
  frescas y parafinadas.
• Evaluar la sensibilidad y especificidad.

6
Esquema del PCR
Taq polimerasa
7
Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.
Materiales y métodos

• Cultivo de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv)
• Biopsias frescas y parafinadas procedentes de
  
• pacientes con sospecha o con tuberculosis
• comprobada.
• Iniciadores para amplificar un fragmento de 245
  pb
• de la secuencia de inserción INS6110 presente
  en
• el Complejo Mycobacterium tuberculosis.
• INS1 5CGT-GAG-GGC-ATC-GAG-GTG-GC
• INS2 5GCG-TAG-GCG-TCG-GTG-ACA-AA

8
Materiales y métodos
AREA DE EXTRACCIÓN
9
Materiales y métodos
Extracción de ADN de Cultivo de M. tuberculosis
(H37Rv)

• TE 400 µl.
• Lisozima al 3.3 50 µl, 37 C, 1h.
• SDS al 20 30 µl, 65 C, 1h.
• Proteinasa K 2 mg/ml 150 µl, 55 C x 18 horas.
• Perclorato de Sodio 3 mM 100 µl, 10.
• Cloroformo - alcohol isoamilico 241, 500 µl,
  30.
• Centrifugación 14.000 r.p.m 15.
• Sobrenadante Etanol Absoluto 1.5 ml Acetato
  de Sodio 30 µl.
• Refrigeración a -20 C, 2 h.
• Centrifugación 14.000 r.p.m 15.
• Suspensión en agua destilada y desionizada.
• Cuantificación 260 nm.

10
Materiales y métodos
AREA DE AMPLIFICACIÓN
11
Materiales y métodos
Amplificación de ADN de cultivo de M.
tuberculosis (H37Rv) Mezcla

• Iniciadores
• INS1 - 5 CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3
• INS2 - 5 GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3
• TE 10x Buffer 5 µl.
• ClMg 25 nM 4 µl.
• Dionucleotidos trifosfatados 2.5 nM.
• Formamida 0.5 µl.
• ADN.
• Agua destilada y desionizada. Volumen total 50
  µl.

12
Materiales y métodos
Amplificación de ADN de cultivo de M.
tuberculosis (H37Rv) Condiciones
Desnaturalización 5 95C Taq
Polimerasa 0.5 ud, 4C Desnaturalización
4 95C Desnaturalización 2
95C Hibridización 2
67C Extensión 2
72C Extensión final 10 72C
35 Ciclos
5 de aumento en cada ciclo.
13
Materiales y métodos
Electroforesis del ADN
Separación de los productos de PCR en gel de
agarosa al 1.5, y visualización mediante luz
ultravioleta después de la tinción con bromuro de
etidio a 0.5 µg/ml.
14
Materiales y métodos
Electroforesis en gel de agarosa a 40 vol.
durante 3 horas
15
Materiales y métodos
Extracción de ADN de biopsias

• Desparafinación 2 fragmentos de 10 µm
• Xilol 500 µl, 55 ºC, 15 x 2 veces.
• Etanol 500 µl al 75 x 2 veces.
• Secado
• Suspensión de la biopsia desparafinada o fresca
  en 400 µl de TE.
• Lisozima al 3.3 50 µl, 37 C, 1h.
• SDS al 20 30 µl, 65 C, 1h.
• Proteinasa K 2 mg/ml 150 µl, 55 C x 2 horas.
• Perclorato de Sodio 3 mM 100 µl, 10.

16
Materiales y métodos
Extracción de ADN de Biopsias

• Cloroformo - alcohol isoamílico 241, 500 µl,
  30.
• Centrifugación 14.000 r.p.m 15.
• Sobrenadante Etanol Absoluto 1.5 ml Acetato
  de Sodio 3 mM 30 µl.
• Refrigeración a -20 C, 2 h.
• Centrifugación 14.000 r.p.m 15.
• Suspensión en agua destilada y desionizada.
• Cuantificación 260 nm.

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Materiales y métodos
Amplificación de ADN de biopsias Mezcla

• Iniciadores
• INS1 - 5 CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3
• INS2 - 5 GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3
• TE 10x Buffer 5 µl.
• ClMg 25 nM 4 µl.
• Dionucleotidos trifosfatados 2.5 nM.
• Formamida 0.5 µl.
• ADN 1 µg.
• Agua destilada y desionizada. Volumen total 50
  µl.

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Materiales y métodos
Amplificación de ADN de biopsias Condiciones
Desnaturalización 5 95C Taq
Polimerasa 0.5 ud, 4C Desnaturalización
4 95C Desnaturalización 4
95C Hibridización 2
67C Extensión 2
72C Extensión final 10 72C
45 Ciclos
5 de aumento en cada ciclo.
19
Resultados
Sensibilidad en ADN del cultivo de Mycobacterium
tuberculosis
1 2 3 4 5 6 7

1. 2 µg,
2. 1 µg,
3. 500 fg,
4. 10 fg,
5. 1 fg.
6. Sin ADN,
7. Marcador de peso molecular 245 pb.

Las lineas muestran diferentes cantidades de ADN
de cultivo de Mycobacterium tuberculosis
amplificado.
20
Resultados
Especificidad del PCR en ADN de diferentes células
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10
La lineas muestran 1µg de ADN amplificado
procedente de diferentes células
240pb
1) Sin ADN 2) M. tb H37Rv 3) M. bovis 4) M.
kansassi 5) M. avium-intracelular 6) Histoplasma
sp 7) E coli 8) Linfocitos humanos 9) Sin ADN 10)
Marcador de peso molecular ladder 123 pb
21
Resultados del PCR en biopsias frescas y
parafinadas.
Grupos Frescas Parafinadas Nº (
PCR) Nº ( PCR) Establecida 4 (75) 10
(100) Probable 5 (80) 14 (86) No TBC
4 (25) 7 (0)
22
Resultados del PCR en ADN de biopsias parafinadas
La lineas muestran 1µg de ADN amplificado
procedente de diferentes biopsias parafinadas.
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11
245pb
1) Sin ADN 2) Endometrio, probable TB 3) Escroto
TB 4) Ganglio linfático 5) Pleura probable TB 6)
Biopsia control positívo 7) Biopsia control
negatívo 8) ADN Mt.b 9) Control de contaminación
de extracción 10) Sin ADN 11) Marcador de peso
molecular 245 pb
23
Resultado del PCR en ADN de biopsias frescas
La lineas muestran 1µg de ADN amplificado
procedente de diferentes biopsias frescas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12
245pb
1) Sin ADN 2) Peritoneo TB 3) Ganglio linfático,
Linfoma 4) Piel, Esporotricosis 5) Pleura,
probable TB 6) Exocervix, probable TB 7) Biopsia
control positívo 8) Biopsia control negatívo 9)
ADN Mt.b 10) Control de contaminación de
extracción 11) Sin ADN 12) Marcador de peso
molecular 245 pb
24
Análisis estadístico para resultados del PCR en
biopsias frescas y parafinadas.
TB Prob. TB Sensibilidad
93 84 Especificidad 91 91 VPP 93
94 VPN 92 79
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Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.

• CONCLUSIONES...
• Con nuestra prueba es posible estudiar tejidos
  frescos y parafinados procedentes de sitios con
  sospecha de enfermedad tuberculosa, en busca de
  secuencias del ADN del complejo Mycobacterium
  tuberculosis con una sensibilidad del 93 en
  tuberculosis establecida y del 84 en
  tuberculosis probable. Una biopsia de ganglio
  linfático cervical fresca se encontró ZN positiva
  y PCR negativa. El cultivo de esta biopsia fue
  negativo. Aunque podría este, ser un falso
  negativo del PCR por inhibición de la prueba lo
  cual no fue buscado, bien podría tratarse de
  infección por micobacterias no tuberculosas las
  cuales no son amplificadas por nuestra prueba que
  sólo detecta ADN del complejo Mycobacterium
  tuberculosis, caso en el cual la sensibilidad
  sería del 100 en tuberculosis establecida.

26
Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.

• CONCLUSIONES...
• De otro modo nuestra prueba adelanta el
  diagnóstico de la tuberculosis establecida por
  cultivo ya que el procedimiento se demora 2 días
  mientras el cultivo 3 a 8 semanas.
• El PCR permitió establecer el diagnóstico en
  lesiones granulomatosas con cultivo y tinción
  negativa con una especificidad del 91, y en este
  grupo de pacientes se constituiría en una prueba
  de gran ayuda para el tratamiento de la gran
  mayoría de ellos con un valor predictivo positivo
  del 79.

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Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en
cadena de la polimerasa en biopsias frescas y
parafinadas.

• BIBLIOGRAFIA...
• 1 Jereb, J.A. Kelly, G.D. Dooley, S.W
  Cauthen, G.M. Snider, D.E. Tuberculosis,
  morbidity in the United States Final data, 1990.
  MMWR 1991 40 (ss-3) 23-28.
• 2 Mandel, G.L., J.E. Bennett and R. Dolin.
  Principles and practice of Infectious Diseases,
  4a Ed. Churchill Livingstone Inc. N.Y. 1995
  2231.
•   3 Cañas G., L.M. Tuberculosis de difícil
  diagnóstico Factores condicionantes en el
  Hospital Universitario San José de Popayán. Tesis
  para optar el título de Especialista en Medicina
  Interna 1993. Biblioteca Ciencias de la Salud,
  Universidad del Cauca, Popayán.
•   4 Hance, A.J. Grandchamp, B. Frébault, V.L.
  Lecossier, D. Rauzier, J Bocart, D. Gicquel,
  B. Detection and identification of mycobacteria
  by amplification of mycobacterial DNA. Molec.
  Microbiol. 1988 3 843-849.

28

• BIBLIOGRAFIA...
• 5 Thierry, D. Cave, M.D. Eisenach, K.D.
  Crawoford, J.T. Bates, J.H. Gicquel, B.
  Guesdon, J.L. IS6110 an IS-like element of
  Mycobacterium tuberculosis complex. Nucleic.
  Acids. Res. 1990 18 188.
• 6 Eisenach, K.D. Cave, M.D. Bates, J. H.
  Crawford, J.T. Polymerase chain reaction
  amplification of a repetitive DNA sequence
  specific for Mycobacterium tuberculosis. J.
  Infect. Dis. 1990 161 977-981.
• 7 Thierry, D. Brisson-Noel, A. Lévy-Frébault,
  V.V. Nguyen, S. Gueston, J.L. Gicquel B.
  Characterization of a Mycobacterium tuberculosis
  insertion sequence, IS6110, and application in
  diagnosis. J. Clin. Microbiol. 1990 28
  2668-2673.
•  
• 8 Cousins, D.V. Wilton, S.D. Francis, B.R
  Gow, B. L. Use of polymerase chain reaction for
  rapid diagnosis of tuberculosis. J. Clin.
  Microbiol.. 1992 30 255-258
• 9 Ellner, P.D. Kiehn, T. E. Cammarata, R.
  Hosmer, M. Rapid detection and identification of
  pathogenic mycobacteria by combyning radiometric
  and nucleic acid probe methods. J. Clin.
  Microbiol.. 1988 26 1349-1352.

29

• BIBLIOGRAFIA...
•  
• 10 Del Portillo, P. Murillo, L.A. Patarroyo,
  M.E. Amplification of a species-specific DNA
  fragment of Mycobacterium tuberculosis it's
  possible use in diagnosis. J. Clin. Microbiol.
  1991 29 2163-
• 11 Eisenach, K.D. Crawford, J.T. Bates, J.H.
  Repetitive DNA secuences as probes for
  Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol..
  1988 26 2240-2245.
• 12 Eisenach, K.D. Sifford, M.D. Donald Cave,
  M. Bates, J.H Crawford J.T. Detection of
  Mycobacterium tuberculosis in sputum samples
  using a polymerase chain reaction. Am. Rev.
  Respir. Dis. 1991 144 1160-1163.
• 13 Sjobring, U. Mecklenburg, M. Andersen, A.B
  Miorner, H. Polymerase chain reaction for
  detection of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin.
  Microbiol. 1990 28 2200-2204.
•  
• 14 Noordhoek, G.T. A.H. Kolk, G. Bjune, D Catty,
  J.W. Dale, P.E. Fine, P. Godfrey-Faussent et al.
  Sensivity and especifity of PCR for detection of
  Mycobacterium tuberculosis A blind comparison
  study among seven laboratories. J Clin Microbiol
  1994 32 277.

30

• BIBLIOGRAFIA...
• 15 Styblo, K. Overview and epidemiologic
  assessment of the current global tuberculosis
  situation with an emphasis on control in
  developing countries Rev. Infect. Dis. 1989
  (suppl 2) s339-s346.
• 16  Polymerase chain reaction for the detection
  of Mycobacterium tuberculosis DNA in tissue and
  assesment of it utility in the diagnosis of
  hepatic granulomas. Diaz ML. Sada E.
  Lopez-Vidal Y. Ruiz Palacios G. J. Lab. Clin. Med
  1996 127 359.
• 17. Bennedsen J, V. O Thomsem, GE Pfyffer, G
  Funke, K Feldmann, A Beneke, PA Jenkins et al.
  Utility of PCR in diagnosing pulmonary
  tuberculosis. J Clin Microbiol 1996 34 1407