ADN Recombinante e Ingieniera Gentica

1
ADN Recombinante e Ingieniería Genética

• Capítulo 16

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Hipercolesterolemia Familiar

• Un gen codifica una proteina que sirve como
  receptor celular para LDL
• Dos alelos normales para el gen mantienen bajos
  los niveles sanguíneos de LDLs.
• Dos alelos mutados producen niveles de colesterol
  anormalmente altos y enfermedad del corazón.

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Ejemplo de Terapia Génica

• Mujer con hipercolesterolemia familiar
• Se le removió parte de su hígado
• Se utilizó un virus para insertar un gen normal
  para el receptor de LDL en las células del hígado
  cultivadas en el laboratorio
• Las células modificadas del hígado se pusieron de
  regreso en la paciente

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Resultados de la terapia génica

• Las células modificadas vivieron en el hígado de
  la mujer
• Los niveles sanguíneos de LDLs bajaron en un 20
• No presentó evidencias de aterosclerosis
• Los niveles de colesterol permanecieron altos
• Falta todavía saber si el procedimiento
  prolongará su vida.

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Cambios Genéticos

• Los humanos han estado cambiando la genética de
  otras especies por miles de años
• seleccion artificial de plantas y animales
• Los procesos naturales también han trabajado
• Mutaciones, crossing over

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Ingieniería Genética

• Los genes son aislados, modificados, e insertados
  dentro de un organismo
• Es posible gracias a la tecnología del ADN
  recombinante
• Corte del ADN y recombinación de piezas
• Las piezas modificadas se pueden amplificar

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Discubriendo las Enzimas de restricción

• Hamilton Smith estaba estudiando la forma en que
  la bacteria Haemophilus influenzae se defiende
  del ataque de los virus bacteriófagos
• Descubrió que la bacteria tiene una enzima que
  corta el ADN viral

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Especificidad de los cortes

• Las enzimas de restricción cortan el ADN en una
  secuencia específica
• El número de cortes hecho en el ADN dependerá
  del número de veces en que la secuencia de
  reconocimiento existe en ese genoma

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Preparando ADN Recombinante
5
G
A A T T C
3
C T T A A
G
one DNA fragment
another DNA fragment
5
G
A A T T C
3
C T T A A
G
5
3
In-text figurePage 254
10
nick
5
3
G
A A T T C
3
C T T A A
G
5
nick
DNA ligase action
G
A A T T C
C T T A A
G
In-text figurePage 254
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Usando Plásmidos

• Un plásmido es un pequeño cromosoma circular de
  ADN bacteriano
• ADN extraño puede ser insertado dentro de un
  plásmido
• Se forman plásmidos recombinantes
• Los plásmidos pueden servir como vectores de
  clonación
• Pueden enviar ADN a otra célula

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DNA fragments enzymes
recombinant plasmids
host cells containing recombinant plasmids
Figure 16.4Page 255
13
Podría escapar del laboratoriouna bacteria
genéticamente modificada?

• Las bacterias genéticamente modificadas son
  diseñadas para que no puedan sobrevivir fuera del
  laboratorio
• Si se liberan al medio ambiente mueren, son
  dependientes de las condiciones del laboratorio.

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Preparando ADNc
mRNA transcript
mRNAcDNA hybrid
single-stranded cDNA
double-stranded cDNA
Figure 16.5Page 255
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Amplificando ADN

• In vivo Los fragmentos pueden ser insertados
  dentro de microorganismos de crecimiento rápido
• In vitro Reacción en cadena de la polimerasa
  (PCR)

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Reacción en cadena de la Polimerasa

• Se calienta la secuencia que se desea copiar
• Se agregan los iniciadores o primers, los cuales
  reconocen su secuencia complementaria y se unen a
  ella
• La ADN polimerasa usa nucleótidos para crear la
  hebra complementaria.
• Se obtienen miles de copias del fragmento deseado.

17
Polymerase Chain Reaction
Double-stranded DNA to copy
Stepped Art
Figure 16.6Page 256
18
Polymerase Chain Reaction
Mixture heated again makes all DNA fragments
unwind
Stepped Art
Figure 16.6Page 256
19
Huellas genéticas o DNA Fingerprints

• Patron de bandas único que se obtiene después de
  una electroforesis del genoma previamente cortado
  con alguna enzima de restricción.
• Se heredan de padres a hijos de una forma
  mendeliana

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Repeticiones en Tandem

• Cortas regiones de ADN que difieren
  sustancialmente entre las personas
• Existen muchos sitios del genoma donde existen
  repeticiones en tandem
• Cada persona es portadora de una única
  combinación de la cantidad de repeticiones.

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RFLPs (Restriction fragment length polymorphisms)

• Polimorfismos de longitud de los fragmentos de
  restricción
• El ADN de regiones con repeticiones en tandem se
  corta con enzimas de restricción
• Debido a la variación en la cantidad de ADN
  repetido, los fragmentos de restricción varían en
  tamaño
• La variación se detecta por una electroforesis

22
(No Transcript)
23
Electroforesis

• El ADN se pone en un pozo en uno de los
  extremos del gel.
• Se aplica una corriente al gel.
• Las moléculas de ADN están cargadas negativamente
  y se mueven hacia el extremo positivo
• Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que
  las moléculas más grandes.

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Analizando huellas genéticas

• El ADN se hace visible mediante el marcaje con un
  isótopo de una sonda de ADN que se hibridiza. El
  patrón de bandas se usa para
• Identificar o rechazar al sospechoso de un crimen
• Identificar cuerpos
• Determinar paternidad

25
(No Transcript)
26
Huellas genéticas con sondas multilocus
27
Secuenciación de Genomas

• 1995 Primera Secuencia en ser determinada
  bacteria Haemophilus influenzae.
• Actualmente se usa la secuenciación automática
  como método principal
• La secuencia borrador del genoma humano
  completo se determinó de esta forma.

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Nucleotidos para secuenciación

• Nucleótidos (A, T, C, G)
• Versiones modificadas de estos nucleótidos
• Marcados para emitir fluorescencia
• Estructuralmente diferentes para que detengan la
  síntesis cuando ellos se unen a la molécula.

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Mezcla para la reacción

• Copias del ADN a ser secuanciado
• Primer
• DNA polimerasa
• Nucleotides
• Nucleótidos Modificados

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Procedimiento de la reacción

• Se sintetiza una hebra complementaria con los
  nucleótidos
• Cuando se incorpora un nucleótido modificado, se
  detiene la síntesis
• Como resultado se obtienen millones de copias de
  longitud variable

31
Obtenciónde la secuencia
Figure 16.8Page 258
T C C A T G G A C C
T C C A T G G A C
T C C A T G G A
T C C A T G G
T C C A T G
T C C A T
T C C A
electrophoresis gel

• ADN se pone en un gel
• Fragmentos migran por el gel en orden de tamaños
  pasan a través de un rayo laser. El color de la
  fluorescencia de cada fragmento se almacena en la
  computadora y se puede imprimir .

T C C
T C
one of the many fragments of DNA
migrating through the gel
T
one of the DNA fragments passing through a laser
beam after moving through the gel
T C C A T G G A C C A
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Bibliotecas de genes

• Bacterias que contienen diferentes fragmentos de
  ADNs clonados
• Bibliotecas Genomicas
• Bibliotecas de ADNs copias

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Usando una sonda para encontrar un gen

• Usted desea saber cual bacteria de todas en una
  librería contiene un gen específico
• Se necesita una sonda del gen
• Una secuencia de ADN del gen, marcada con
  radio-isótopo que reconocerá su secuencia
  complementaria en la librería.

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Uso de una sonda
Colonies on plate
Cells adhere to filter
Cells are lysed DNA sticks to filter
Probe is added
Location where probe binds forms
dark spot on film, indicates colony with gene
Figure 16.9Page 259
35
Ingieniería de proteinas

• Las bacterias pueden ser usadas para obtener
  miles o millones de copias de moléculas de una
  proteina de interés médico
• Insulina, interferon, Factores de coagulación de
  la sangre
• Vacunas

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Limpieza del ambienteBio-remediación

• Existen microorganismos que normalmente digieren
  basura orgánica y reciclan materiales
• Algunos pueden ser usados por la ingieniería para
  digerir contaminantes o grandas cantidades de
  materiales peligrosos.

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El plásmido Ti

• Investigadores
• reemplazan genes que causan tumores por genes
  beneficiosos
• Los plásmidos transfieren estos genes a celulas
  vegetales en cultivo

plant cell
foreign gene in plasmid
Figure 16.11Page 261
38
Ingieniería de plantas

• Plantas de algodón pueden hacerse resistentes a
  hierbicidas
• Plantas de aspen pueden producir menos lignina y
  más celulosa
• Plantas de tabaco pueden producir proteínas
  humanas
• Células de la planta de mostaza pueden producir
  plástico biodegradable.

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Primeros mamíferos manipulados genéticamente

• Usaron ratones deficientes en hormona del
  crecimiento (enanos)
• Los huevos fertilizados de ratón fueron
  inyectados con el gen de rata para la hormona del
  crecimiento
• Gen se integróal ADN del ratón
• Ratones modificados fueron 1,5 veces mas grandes
  que sus hermanos no modificados

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Clonando a Dolly

• 1997 - Una oveja fué clonada a partir de una
  célula de adulto.
• Un nucleo de una célula de la glándula mamaria
  fué insertado en un ovulo sin núcleo
• El embrion fué implantado en una madre sustituta
• La oveja obtenida es una copia genética del
  animal del cual se obtuvieron las celulas de las
  glándulas mamarias

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Diseñando Ganado

• Embriones de ganado vacuno se pueden hacer crecer
  en cultivo y modificados genéticamente para
• - crear resistencia a enfermedades
• Hacerlos producir albúmina humana u otras
  proteinas de uso médico.

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Proyecto del Genoma Humano, U.S.A.Human Genome
Organization HUGO, 1988

• 1990 planeado para 15 años
• Mapear y secuenciar el genoma humano.
• Desarrollar tecnologías y métodos.
• Mapear y secuenciar genes de 5 organismos
  modelos E.coli, Saccharomyses cerevisiae, C.
  elegans, D. melanogaster y el ratón.
• Estudiar las implicaciones éticas y legales del
  proyecto (Subproyecto ELSI).

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P o l i m o r f i s m o s
Enfermedades
CLONES
Anormalidades cromosómicas
ADNc
ADNg
Familias
Híbridos celulares FISH Clones contiguos etc.


Ligamiento
Mapa genético
Mapa físico
Mapa RATON

MAPA DEL GENOMA HUMANO
Secuenciación
Identificación de genes
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Proyecto del Genoma Humano

• Se hizo en centros con capacidad industrial de
  secuenciar
• Wellcome Trust Sanger Institute en Reino Unido.
• The Whitehead Institute y el Institute of
  Technology of Massachussetts.
• Washington University
• DoE Joint Genome Institute.
• Baylor College of Medicine
• Y una red de pequeños laboratorios en todo el
  mundo

45
08_01.jpg
Proyecto Genoma Humano
46
Proyecto del Genoma Humano

• Se desarrollaron grandes bases de datos de acceso
  gratuito por Internet, para los datos obtenidos
  con fondos públicos
• Datos de mapeo y secuenciación de ADN y
  proteínas. Ej Genome database (GDB). Estos pueden
  ser accesados y analizados desde cualquier parte
  del mundo.
• Datos de interés local obtenidos por cada
  laboratorio.

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Fechas importantes en el Mapeo y Secuenciación
del Genoma Humano

• 1977 Fred Sanger metodo de secuenciación usando
  dideoxinucleótidos.
• 1980 Bolstein et al propuso mapear con RFLPs
• 1981 Sanger publicó la secuencia mitocondrial
  completa
• 1987 El departamento de energía de los Estados
  Unidos ve la necesidad de hacer el proyecto del
  genoma humano
• 1988 Se crea el Centro Nacional para el estudio
  del Genoma Humano adscrito a los Institutos
  Nacionales de Salud. USA.
• 1990 lanzamiento oficial del proyecto
• 2001 Publicación del primer borrador de la
  secuencia del genoma humano (90), por parte de
  Celera Genomics.
• 2003 Secuencia completa del genoma Humano

48
Proyecto del Genoma Humano

• se necesitaron más de 10 años, más de 1.000
  científicos y aproximadamente 2.000 millones de
  dólares, de los cuales solamente entre un 3-5 se
  han destinado al subproyecto ELSI, el cual
  financia investigaciones sobre los aspectos
  éticos, legales, y sociales asociados al nuevo
  conocimiento.

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Beneficio vrs riesgos

• Como cualquier conocimiento científico o avance
  tecnológico, éste puede traernos gran cantidad
  de beneficios, si se maneja con una visión
  humanista y solidaria, obedeciendo valores
  fundamentales como el respeto a la vida, a la
  privacidad, el derecho a la salud y de aspirar
  cada día a una mejor calidad de vida y el
  derecho de proteger la identidad genética.
• Por el contrario si es usado en forma
  inescrupulosa, con fines comerciales o raciales
  podría conducirnos a una sociedad cada día más
  deshumanizada.

50
Temores

• Los ciéntificos y el público en general han
  manifestado preocupaciones el posible irrespeto
  a la dignidad humana, la discriminación contra
  personas con desbalances genéticos, o portadoras
  de alguna mutación que les confiere un riesgo
  mayor de llegar a desarrollar alguna enfermedad
  degenerativa, incapacitante o que les acorte la
  vida. Esta discriminación se podría traducir en
• 1. Pago de mayores primas en seguros de salud o
  total ausencia de cobertura, en los países donde
  la salud es asegurada por empresas privadas
  (afortunadamente, todavía no es el caso de Costa
  Rica).

51
Temores

• 2. Obstáculo para obtener un trabajo, etc.
• Los expertos del subproyecto ELSI recomendaron
  legislar urgentemente con el fin de proteger la
  información genética de los individuos porque
  los temores mencionados tienen fundamento, y
  porque los incentivos económicos para cometer
  discriminaciones aumentarán, conforme aumente la
  investigación genética y bajen los costos del
  tipeo genético de los individuos. Por lo que se
  deben penalizar las acciones de discriminación.

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Desafíos

• Existen aspectos éticos que están en discusión y
  que atañen a toda la sociedad, se pueden
  señalar el uso de la información, la privacía y
  confidencialidad, quién es el dueño de la
  información, el impacto sicológico y la
  estigmatización social, el tamizaje genético
  individual (por pertenecer a una familia con
  historia de enfermedad genética) o poblacional
  (recién nacidos, prematrimonial y ocupacional),
  aspectos reproductivos, derecho a la
  reproducción, terapia génica, intervenciones
  genéticas, disponibilidad del uso de las
  tecnologías genéticas, acceso y financiamiento,
  aspectos clínicos, comercialización,.
  implicaciones filosóficas y conceptuales.