Biotecnolog

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Biotecnología Vegetal Transformación génica en
plantas
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Biotecnología Vegetal

• La biotecnología consiste en la utilización de
  organismos vivos con fines industriales

• Conjunto de técnicas que utilizan organismos
  vivos o parte de ellos para obtener productos o
  modificarlos, para mejorar plantas o animales, o
  para desarrollar microorganismos con fines
  determinados

• Se utilizan las técnicas de ingeniería genética
  y cultivo de tejidos vegetales in vitro

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Planta transgénica Se introduce un DNA foráneo en
el genoma de sus células, este DNA se expresa y
confiere a la planta un carácter o unos
caracteres nuevos
Sistemas de transformación genética en plantas

• Sistemas de transferencia de ADN basados
• en vectores biológicos
• - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
• y Agrobacterium rhizogenes.
• - Sistemas basados en virus
  vegetales.
• Sistemas de transferencia directa de ADN
• - Transferencia por biobalística
  (micropartículas de oro o tungsteno que tiene
  aglomerado el DNA foráneo).
• - Transferencia mediada por
  cationes divalentes
• y/o electroporación
• - Transferencia por
  microinyección.

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Para qué plantas transgénicas?

• Rendimiento y calidad nutricional
• Biorreactores
• Estudio de procesos biológicos

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Rasgos introducidos

• Resistencia a
• insectos
• herbicidas
• virus, hongos, bacterias
• Retraso de senescencia, tolerancia a estrés
• Mejora del valor biológico (proteínas, lípidos)
• Producción de polipéptidos de uso farmacológico.

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• Biotecnologías de apoyo al mejoramiento de
  plantas
• Cultivo de tejidos
• Rescate de embriones
• Embriogénesis somática
• Organogénesis somática
• Producción de haploides
• Fusión de protoplastos
• Trasformación genética
• Agrobacterium tumefaciens
• Agrobacterium rhizogenes
• Métodos directos
• Métodos Indirectos

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• Cultivo de tejidos ?Factores comunes
• Composición general de medios de cultivo
• Fuente de Carbono (azúcares)
• Macronutrientes (N, K, etc)
• Micronutrientes (Fe, Cl, etc)
• Vitaminas
• Agente gelificante (para medios sólidos)
• Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales)
• Otros compuestos (ej agentes quelantes)

ambientación
asepcia
cultivo
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Cultivo de tejidos Rescate de embriones
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Cultivo de tejidos Embriogénesis somática
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• Cultivo de tejidos Organogénesis somática
• Propagación masiva
• Flores
• Frutales
• Árboles forestales
• Cultivo de meristemas
• Saneamiento de virus
• Rejuvenecimiento

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Cultivo de tejidos Producción de haploides
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Cultivo de tejidos Fusión de protoplastos
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Transformación genética ?Técnicas básicas

• Enzimas de restricción
• Clonación de genes
• Secuenciación
• Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN
• Hibridación con anticuerpos (western blot)
• Hibridación de ácidos nucleicos (southern,
  northern)
• Reacción de la polimerasa en cadena (pcr)

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Transformación genética ?Técnicas
básicas Enzimas de restricción Clonación
en plásmidos (vectores)
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Transformación genética ?Técnicas
básicas Clonación en plásmidos (vectores)
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Transformación genética ?Técnicas
básicas Secuenciación
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Transformación genética ?Técnicas básicas
Secuenciación
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Transformación genética ?Técnicas
básicas Electroforesis (DNA, RNA,proteinas)
southern
northern
western
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Transformación genética ?Técnicas
básicas Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)
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Métodos indirectos

• Agrobacterium tumefaciens
• Agrobacterium rhizogenes

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Transformación genéticaA. tumefaciens
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Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Bacteria del suelo Gram (-)
Tumor de tallo provocado por Agrobacterium
tumefaciens
Agallas en corona
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Agrobacterium tumefaciens Bacteria Gram negativa
que infecta a las plantas en lugares donde hay
heridas y produce la enfermedad de las agallas en
corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas.
Las agallas son protuberancias formadas por
conglomerados de células indeferenciadas
El plásmido Ti (tumor-inducing) es el
responsable de la inducción de tumores, durante
la infección se transfiere una porción definida
de este plásmido T-DNA (DNA de transferencia)
La integración y expresión de ciertos genes del
T-DNA (oncogenes) hace que las células
transformadas se dividan sin control. Codifican
para la síntesis de fitohormonas (auxinas y
citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para
la bacteria).
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(No Transcript)
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Qué son los genes vir?

• Codifican factores esenciales para la
  transferencia e integración del T-DNA dentro del
  genoma de la planta.
• Están ubicados en una regíón de 35 kb del
  plásmido Ti fuera de la región del T-DNA.
• Hay 25 genes vir distribuídos en 7 operones.
• Responden a un metabolito secundario exudado por
  las plantas cuando se les provoca una herida
  (acetosiringona)

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(No Transcript)
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Transformación genéticaA. tumefaciens
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Vectores derivados del plásmido Ti

• Componentes necesarios
• Marcador de selección (resistencia a kanamicina)
• Origen de replicación (para que se replique en
  E.coli)
• Borde derecho de la secuencia T-DNA
• Polylinker (región de multiple clonaje)
• Tipos
• binarios
• cointegrados

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(No Transcript)
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Transformación genéticaA. tumefaciens
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Se inocula con Agrobacterium desarmada que
contenga un vector de transformación. El T-DNA
contiene un módulo de expresión y el gen de
resistencia a la kanamicina El medio además de
hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima
(para controlar el crecimiento de Agrobacterium)
y kanamicina (antibiótico de selección)
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(No Transcript)
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Cultivo de raíces de tabaco transformadas por
Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes
En este caso se utiliza como vector de
transformación la bacteria con su plásmido Ri
intacto y además se introduce otro plásmido que
contiene los genes quiméricos dentro del T-DNA.
Puede dar fenotipos aberrantes en la parte aérea
de la planta
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
Gentileza del Dr. Mark Tepfer
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Métodos directos

• Bombardeo de partículas (biobalistica)
• Electroformación de Protoplasto
• Fibras de carburo de silicio Whiskers
• Transformación mediada por Glicol de polietileno
  (PEG)

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Transformación genéticaBiobalística
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(No Transcript)
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Manipulación de la expresión génica

• Promotores
• constitutivos (35S del virus del mosaico del
  coliflor)
• tejido específicos (FBPasa - Rubiscom)
• inducibles
• Secuencias enhancer
• Intrones que estabilizan el mRNA producido
• Secuencia terminadora (nopalina sintasa)

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Manipulación posttranscripcional

• Antisentido
• Se transfiere un gen que codifica para un RNA
  complementario (asRNA) al mRNA de interés.
• Al transcribirse ambos genes se forma un híbrido
  asRNA-mRNA que impide la traducción del último.

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GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN
PLANTAS TRANSGÉNICAS
Tipo de gen utilizado en transgénesis
Caracter que confiere a la planta
Toxina de Bacillus thuringensis Proteína de la
cubierta viral Quitinasas, glucanasas de plantas
y de otros organismos Lisozima humana y de
cerdo. Otros péptidos bactericidas Genes cuyos
productos afectan la biosíntesis de aminoácidos,
o la fotosíntesis Genes cuyos productos afectan
la biosíntesis del etileno, o la formación de
pared celular
Resistencia a Insectos Resistencia a
Virus Resistencia a Hongos Resistencia a
Bacterias Resistencia a Herbicidas Retraso
maduración de frutos
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(No Transcript)
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OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE
MODIFICADAS
AbetoAcelgaAlfalfaAlgodónAlamoArabidopsisArr
ozArvejaCamoteCaña de azucarCebadaCentenoCla
velCrisantemoEspárrago
Eucalyptus Frambuesa Frutilla Kiwi Lechuga Lirio M
aíz Maní Manzana Maravilla Orquidea Papa Papaya Pe
tunia Pera
Pino Plátano Poroto Poroto de soya Remolacha Repol
lo Rosa Sorgo Tabaco Tomate Tulipán Trigo Vides Za
nahoria Zapallo
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MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Transformación de Plantas
Biobalística o Agrobacterium
Mejoramiento Genético
Resistencia a Herbicidas
Calidad del Producto
Resistencia a Patógenos
Esterilidad Sexual
Roundup Listo
Materna Paterna
Color
Postcosecha
Hongos
Bacterias
Insectos
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Glifosato
Glifosato
Bromoxinil
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Asignacion

• Definicion
• Rescate de embriones
• Embriogénesis somática
• Organogénesis somática
• Producción de haploides
• Fusión de protoplastos
• Plasticidad
• Totipotencia
• Monocotiledodeas
• Dicotiledoneas