Diapositiva 1

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Técnicas en Biología y Genética Molecular
Clonación DNA Cortar el DNA en lugares
precisos. Seleccionar el vector apropiado
Unión de los dos fragmentos covalentemente (DNA
recombinante) Introducción del el DNA
recombinante en célula huésped (amplificación).
Selección de células huésped que contengan el DNA
recombinante ( Purificación del DNA o
purificación de la proteína Expresada pro el gen
clonado)
2
(No Transcript)
3
(No Transcript)
4
Endonucleasas de restricción.
Enzimas producidos de manera natural por
microorganismos cuya función es la de degradar
el DNA exógeno. Unen específicamente a
secuencias concretas de DNA de doble cadena y la
rompen (endonucleasas).
Tipo I poseen actividad metilasa y de
restricción. ATP-dependientes. Rompen el DNA
lejos del sitio que reconocen (gt1Kbp) de manera
aleatoria ? carecen de interés práctico.
Tipo III poseen actividad de restricción y
modificación. Cortan fuera de la Secuencia que
reconocen. Requieren dos secuencias de
reconocimiento en orientación opuesta en la
misma cadena de DNA. Son ATP-dependientes.
Tipo II sólo actividad de restricción. No
ATP-dependientes. Reconocen secuencias
palindómicas específicas de DNA (de 4 a 8 bp).
Punto de rotura característico para cada uno y
próximo a la secuencia reconocida ?
fragmentos discretos. Hay cientos
comercialmentedisponibles.
5
Endonucleasas de restricción (Tipo II)
6
Endonucleasas de restricción (Tipo II)

• Probabilidad de encontrar dianas 44 (256 bp), 46
  (4.096 bp), 48 (65.536 bp), etc.
• Obtención de fragmentos de mayor tamaño
  digestión parcial.

EXTREMOS COHESIVOS (Sticky ends) dejan entre 2 y
4 nt. Desapareados en una cadena.
EXTREMOS ROMOS (blunt ends) cortan ambas cadenas
en bases opuestas.
ISOESQUIZÓMEROS Enzimas que reconocen la misma
secuencia pero no siempre la cortan igual.
7
Endonucleasas de restricción (Tipo II)
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Enzimas de modificación (metilasas).
S-Adenosil Homocisteína
S-Adenosil Metionina (SAM)
El producto metilado no suele ser reconocido por
el correspondiente ER (hay excepciones). P.e.
metilasas dam de E. coli. Reconocen
-GATC-. Isoesquizómeros pueden tener
sensibilidades diferentes ante una
misma secuencia metilada. DNA aislado de cepas
Dam es resistente a digestión con MboI (GATC).
pero no a Sau3A (GATC) (Sau3A sensible a la
metilación).
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Enzymes with Recognition Sequences Completely
Overlapping Dam Methylase Site GATC
A - N6-methyladenine (m6A)Recognition sequence
is indicated in bold.Overlapping methylase
sequence is green shaded.
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Unión covalente de cadenas de DNA Las DNA ligasas
3
5
11
DNA ligasas
DNA ligasa del bacteriófago T4. Requiere ATP y
Mg2. Extremos cohesivos y romos. dsDNA o
dsRNA. DNA ligasa de E. coli. Requiere NAD.
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Unión a represor Lac I
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Polinucleótido quinasa
Cataliza la transferencia de un fosfato desde el
ATP hasta el extremo 5' de DNA o RNA.
Utilidad 1.- Marcaje (p. ej. Radioactivo) de
oligonucleótidos para estudios de hibridación 2.-
Fosforilación de extremos 5 no fosforilados,
necesarios para ligación, de linkers
(adaptadores) o fragmentos de DNA.
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DNA Polimerasas
Dirigidas por DNA E. coli DNA Polimerasa I (y
fragmento de Klenow) T7 DNA Polimerasa DNA
Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent, etc.)
Dirigidas por RNA Transcriptasas Reversas
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E. coli DNA polimerasa I

• Proofreading activity
• Verifica nts después de ser añadidos.
• Permite eliminar nts desapareados en extremos
  3 y generar extremos romos .
• No deseable para
• Marcar DNA
• Incorporación de nts marcados con mol.
  fluorescentes.
• Partial filling en 5 protuberante con un sólo
  dNTP.

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E. coli DNA polimerasa I
DNA Pol I tiene actividad exonucleasa 5'?3'
Puede extender la síntesis de DNA via
nick-translation. La actividad nick-translation
restulta en la degradación de los primers de RNA.
El resultado final es una serie de nicks en la
cadena de DNA (ahora 100 DNA) La DNA ligasa une
los fragmentos discontinuos de DNA.
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Fragmento de Klenow de la E. coli DNA polimerasa I
Second strand synthesis of cDNA. Filling-in
or labeling recessed 3'-termini of
double-stranded DNA. Labeling of DNA by the
random primer method. DNA sequencing by the
method of Sanger. Site-specific mutagenesis of
DNA with synthetic oligonucleotides.
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T7 DNA Polimerasa

• Carece de actividad exo 5-3. Modificable
  química o genéticamente para eliminar actividad
  exo 3-5 ? SequenaseTM)
• - Muy procesiva muy útil en secuenciación de DNA
  (Sequenase) por el método de Sanger.

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DNA Terminal transferasa

• Adición de nts al extremos 3 del DNA
• - ssDNA (incluyendo extremos 3 protuberantes de
  dsDNA).
• - Añade también homopolímeros de ribonucleótidos
  al extremos 3 de DNA
• - Con menor eficiencia en blunt ends y recessed
  ends

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DNA Terminal transferasa
21
DNA Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent,
etc)
1976 Thermus aquaticus ? 1988 polymerase chain
reaction (PCR)
Primer-directed enzymatic amplification of DNA
with a thermostable DNA polymerase. Science.
1988, 239(4839)487-91

Máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC. (Taq
polimerasa sólo 10 activ. a 37 ºC)
Muy utilizadas en reacciones de PCR y
secuenciación de DNA
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(No Transcript)
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DNA polimerasas dirigidas por RNA Transcriptasas
Reversas
Codificadas por retrovirus (Moloney murine
leukemia o Avian myeloblastosis)

• Usos
• generación de cDNA
• RT-PCR

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(No Transcript)
25
Resumen de las características de las DNA
Polimerasas
26
(No Transcript)
27
La reacción de PCR
http//www.pcrlinks.com/
28
La reacción de PCR DNA Polimerasas
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La reacción de PCR aplicaciones (I)
Posibilidad de introducir cambios en las
secuencias Dianas de restricción
Mutaciones puntuales Identificación de nuevos
miembros de familias de proteínas
30
La reacción de PCR aplicaciones (II)
Diagnóstico de enfermedades genéticas.
Detección de mutaciones por inserción o
delección Mutaciones puntuales.
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Reverse transcription PCR (RT-PCR) y Real-time PCR
32
(No Transcript)
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Síntesis química de oligonucleótidos
Proceso cíclico en el que cada nucleótido es
incorporado secuencialmente (desde 3 a 5) para
formar una cadena de nucleótidos.
El nucleótido 3 es covalentemente unido a un
soporte sólido, y sobre el se van añadiendo
monómeros de uno en uno en un proceso que
implica cuatro reacciones químicas Detritilació
n Acoplamiento Capping Oxidación
El producto final contiene extremos 5-OH y
3-OH (no fosforilado).
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Síntesis química de oligonucleótidos
5-OH
3-OH
A
35
(No Transcript)
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Detritylation The acid-labile DMT group of the
support-bound monomer is removed with
Dichloroacetic acid (DCA) in order to get a free
5- OH group. Coupling The 3-end of the next
nucleotide monomer is activated by tetrazole.
Tetrazole, a weak acid, protonates the tertiary
nitrogen group of the phophoramidites so that the
diisopropylamine moiety becomes a good leaving
group. The nucleophilic attack by the free
5-hydroxyl group on the 3phosphorous of the
incoming activated monomer results in a
internucleotide binding. Capping The unreacted
chains (failure sequences) must be capped to
prevent further elongation in the next cycles.
For this step, acetic anhydride and
N-methyl-imidazole are mixed to form an activated
acetylating agent. Oxidation The trivalent
phosphate bond is oxidised with iodine to a more
stable pentavalent bond. Steps 1 through 4 are
repeated, beginning with the detritylation step,
until the chain elongation is complete.
37
(No Transcript)
38
Marcaje de ácidos nucleicos Síntesis de DNA
uniformemente marcado.
a) Nick translation
Incorporación dNTP marcados por act.
polimerasa de DNA pol. I
3
c) Mediante PCR
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Marcaje de ácidos nucleicos Marcaje del extremo
del DNA.
d) Extremos 5 del DNA con la polinucleótido
quinasa de T4. Método eficiente para marcar
oligonucleótidos (no fosforilados en 5).
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Separación de fragmentos de ácidos nucleicos
Electroforesis de DNA y RNA
Electroforesis en gel de agarosa
Transcurso de la electroforesis (30-60 min)
Fabricación del gel
Siembra de las muestras
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Menor rango de separación pero mayor resolución
que los geles de agarosa.
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Electroforesis de DNA
Electroforesis en gel de agarosa
-

DNA plasmídico digerido con diferentes enzimas
de restricción
Efecto de la concentración de agarosa en la
migración
42
La técnica de Southern blot
43
La técnica de Southern blot
44
Electroforesis de RNA
45
Secuenciación de DNA (manual)
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Secuenciación de DNA (automática en gel)
47
Secuenciación de DNA (automática en capilar)
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Microarrays de DNA
Clones de DNA/ Oligonucleótidos
DNA/mRNA
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Microarrays de DNA
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Microarrays de DNA
canal 1 canal 2
lt1 .1 . gt1
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Microarrays de DNA
Genes más expresados en la muestra control que en
el mutante
Genes menos expresados en la muestra control que
en el mutante
Canal 2 (mutante)
Canal 1 (control)
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Microarrays de DNA
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http//www.nlm.nih.gov/
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Search veterinary, dna, microarrays
Characterization of ovine hepatic gene
expression profiles in response to E. coli
lipopolysaccharide using a bovine cDNA
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Transcript profiles of some developmentally
important genes detected in bovine oocytes and in
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http//www.nlm.nih.gov/
Search veterinary, dna, microarrays, spain
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