Terapia genica

1
Terapia genica

• Inibizione mirata dellespressione genica per
  bloccare un processo patologico
• Distruzione mirata geneticamente di specifiche
  cellule
• Supplementazione fornire una copia funzionante
  del gene difettoso
• Sostituzione sostituire il gene mutante con una
  copia funzionante in situ

2
(No Transcript)
3
(No Transcript)
4
(No Transcript)
5
Supplementazione fornire una copia funzionante
del gene difettoso

• ex vivo trasferire i geni clonati in cellule in
  coltura, selezionare le cellule, espanderle in
  vitro e poi immetterle nel paziente
• in vivo trasferire direttamente i geni nel
  tessuto bersaglio o in circolo, facendo in modo
  che poi arrivi al tessuto bersaglio

6
ex vivo
7
Vettori non virali per la terapia genica

• Liposomi vescicole sintetiche che si formano
  quando alcuni lipidi sono in soluzione acquosa.
  Possono essere anionici e circondano il DNA o
  cationici e legano il DNA allesterno
• iniezione diretta di plasmidi o bombardamento del
  tessuto del DNA attaccato a pellets di metallo
  (biolistico). Il trasferimento è molto basso e il
  DNA non è integrato.

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Liposomi
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Virus per la terapia genica

• Retrovirus sono ad RNA e sintetizzano cDNA che
  integrano casualmente nel genoma dellospite
  quando si dissolve la membrana nucleare
  (divisione cellulare)
• Adenovirus sono a DNA e capaci di trasdurre ad
  alti titoli tutte le cellule, ma in forma
  episomale. E molto forte la reazione
  immunitaria. Morte di Jesse Gelsinger nel 1999
• Adeno-associati (AAV) hanno DNA a singola elica e
  si potrebbero integrare sul cromosoma 19q13
  grazie al gene rep. Ma il 96 del genoma è
  deleto. Possono ospitare fino a 4.5kb
• Lentivirus sono retrovirus specializzati che
  infettano anche le cellule non in divisione. Sono
  più complessi dei retrovirus e sono capaci di
  unespressione a lungo termine.

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Vettori virali per la terapia genica
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Virus Adeno-associato
Famiglia Parvoviride Genere Dependovirus Genoma
DNAss 4.7kb Bersaglio Cellule in divisione e
cellule non in divisione Stato
episomale/integrazione sito specifica su 19q13.3
Sierotipi 10 AAV1-10

AAV2
ITR
ITR
Rep
Cap
Rep52
VP1
Rep78
VP3
Rep68
Rep40
VP2
12
AAV RICOMBINANTI
TRANSGENE
REP
CAP
ITR
p5
p19
p40
ITR
Plasmide Cis
TRANSGENE TERAPEUTICO MAX 4.5kb
ITR
ITR
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Produzione di vettori rAAV
rep2
cap
pro
Trans
ITR2
ITR2
Transgene
pA
E2A
E4
VAI
Cis
Adeno Helper
Tripla trasfezione
HEK 293 cells (E1)
rAAV
14
AAV2/1 (6)
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DIFFERENZE TRA SIEROTIPI AAV 1-8
PROTEINE CAPSIDE

• ANTIGENICITA

• TROPISMO
• AAV1 Muscolo,retina
• AAV2 Muscolo,fegato
• AAV4 Cervello
• AAV5 Cervello,polm.
• AAV6 Muscolo,retina
• AAV7 Muscolo,fegato
• AAV8 Fegato

• RECETTORI
• AAV2 FGFR1,EPARINA
• AAV4
• Ac.SIALICO
• AAV5
• PDGFR, Ac.SIALICO

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Vantaggi

• Non patogeni

• Espressione genica efficiente e a lungo termine

• Pochi effetti immunologici

• Ampia varietà di cellule ospiti

• Infezione di cellule in divisione e non in
  divisione

Svantaggi

• Dimensioni dellinserto non superiori alle 4.5kb

AAV2

• Produzione di anticorpi anti-AAV

No risomministrazione del vettore virale
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Analisi di linkage

• Vincenzo Nigro
• Dipartimento di Patologia Generale
• Seconda Università degli Studi di Napoli

Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
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trasmissione autosomica dominante
un genitore
entrambi i genitori
Aa
aa
Aa
Aa
A allele patologico dominante a allele
normale recessivo
aa
aa
AA
Aa
aa
Aa
Aa
Aa
75 dei figli manifestano il carattere senza
preferenza di sesso
50 dei figli manifestano il carattere senza
preferenza di sesso
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Espressività

• Espressività grado con il quale la malattia è
  espressa in un individuo
• al livello di popolazione un fenotipo presenta
  espressivita variabile quando allinterno
  dellinsieme di soggetti sicuramente portatori
  il fenotipo presenta gravita e/o complessita
  diversa
• anche allinterno della famiglia ci puo essere
  espressivita variabile
• importanza di un accurato esame clinico esteso ai
  consanguinei di un affetto, anche apparentemente
  sani
• Il tipo e la gravità delle manifestazioni
  cliniche non sono sempre sovrapponibili negli
  individui affetti dalla stessa patologia
  autosomica dominante

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mutazioni eterozigoti di PAX3Waardenburg

• sordità (o deficit uditivo di vario livello)
  bilaterale,
• modifiche nella pigmentazione, sia dei capelli
  (albinismo parziale, in genere piebaldismo) che
  della pelle,
• anomalie nello sviluppo dei tessuti derivati
  dalla cresta neurale
• lateralizzazione del canto mediale
• diverso colore degli occhi (eterocromia), di
  solito uno marrone e l'altro blu

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Espressivita variabile

SINDROME DI WAARDENBURG

Sindrome completa sordita occhi di colore
diverso ciuffo di capelli bianchi sulla fronte
precoce incanutimento
1 sordità 2 sordità occhi di colore diverso 3
sordità occhi di colore diverso ciuffo di
capelli bianchi sulla fronte 4 ciuffo di capelli
bianchi sulla fronte precoce incanutimento
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esordio variabile

• il fenotipo puo comparire in età avanzata
• il fenotipo non è congenito pur essendo
  ereditario
• dal punto di vista genetico raramente questi
  fenotipi sono dovuti a nuove mutazioni
• a livello di popolazione lallele mutato puo
  essere frequente, purché l insorgenza si
  verifichi dopo linizio delletà riproduttiva e
  non limiti la fitness (capacita di riprodursi)

23
penetranza

• proporzione di individui portatori del gene
  patologico che hanno segni clinici della malattia
• può dipendere
• accuratezza diagnostica (esami clinici e di
  laboratorio mirati - es. porfiria acuta)
• età (esordio variabile - es. Corea di
  Huntington)
• meccanismo dazione del gene (retinoblastoma,
  teoria dei 2 hits di Knudson)

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tratti autosomici dominantipenetranza
Penetranza 100
Penetranza 50
25
penetranza

• la penetranza è un concetto che si riferisce alla
  popolazione
• A livello del singolo individuo il carattere ha
  solo due possibilità
• si manifesta
• non si manifesta
• è presa in considerazione più frequentemente nei
  caratteri dominanti

Sapere che un gene puo non essere completamente
penetrante, e critico per studiarne la genetica
o fornire consulenza genetica un certo soggetto
che non manifesta il carattere puo essere
portatore del gene.
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Età di insorgenza della Corea di Huntington

1. Probabilità che un individuo portatore del gene
   mutato abbia sviluppato i sintomi ad una data età
2. Rischio che il figlio sano di un soggetto affetto
   sia portatore del gene mutato ad una determinata
   età.

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Penetranza ed espressivita
La penetranza ridotta non e da confondere con
lespressivita variabile
Lespressivita e il grado di gravitacon cui
fra gli individui che presentano il fenotipo
questo si esprime puo costituire un
sottoinsieme degli individui penetranti
Es. Neurofibromatosi presenza di tumori lungo i
nervi periferici e regioni di pigmentazione scura
(macchie di caffelatte)Tutti i portatori
presentano almeno uno dei segni, ma la gravita
puo essere diversa anche allinterno della
stessa famiglia un genitore con macchie e
piccoli tumori cutanei benigni puo avere un
figlio che presenta tumori estesi e maligni.
(questa differenza non e prevedibile si puo
solo quantizzare il rischio di ereditare lallele
non il fenotipo)
28
ipotesi sul rischio di ricorrenza

1. La malattia non è genetica
2. La malattia è dovuta a nuova mutazione dominante
   rischi di ricorrenza trascurabili nella prole
   della coppia
3. La trasmissione è autosomica recessiva rischio
   di ricorrenza di 1 su 4 per la futura prole
   indipendentemente dal sesso
4. La malattia è legata allX recessiva e la madre
   può essere o meno portatrice rischio di
   ricorrenza di 1 su 2 maschi se la madre è
   portatrice
5. La malattia è poligenica o cromosomica rischio
   di ricorrenza ben definito dipendente dal tipo di
   malattia

29
mappaggio genico

• serve ad identificare la posizione cromosomica di
  un locus genico
• possono essere mappati
• marcatori genetici anonimi, quali brevi sequenze
  di DNA (dette STS), DNA microsatelliti, ecc.
• geni
• loci associati a malattie con trasmissione
  mendeliana
• loci associati a predisposizione a malattie con
  trasmissione nonmendeliana

30
a cosa serve il mappaggio in genetica medica?

• per identificare la localizzazione dei geni
  malattia
• per fare diagnosi indiretta in una famiglia in
  cui la mutazione responsabile di una malattia
  genetica mendeliana non è stata ancora
  identificata
• per identificare i geni responsabili della
  suscettibilità a malattie non mendeliane

31
per localizzare e identificare geni malattia
Linkage mapping
32
per fare diagnosi indiretta in una famiglia in
cui la mutazione responsabile di una malattia
genetica mendeliana non è stata ancora
identificata
33
per identificare i geni associati ad una
suscettibilità a malattie non mendeliane
34
Segregazione e crossing-over
un figlio riceve un cromosoma da ciascun genitore
che è il prodotto finale della ricombinazione
meiotica Non è possibile ricevere un cromosoma
che non abbia effettuato crossing-over
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principi generali del mappaggio

• si segue la segregazione della patologia nei
  pedigrees utilizzando marcatori genetici a
  posizione nota
• si correla la segregazione della patologia e dei
  marcatori in più famiglie
• quanto più spesso la patologia e un marcatore
  co-segregano tanto più sono vicini

36
cè bisogno di famiglie abbastanza grandi in cui
si osserva la trasmissione della patologia
37
i membri della famiglia devono essere
genotipizzati usando marcatori polimorfici
marcatori polimorfici sono noti per ogni
cromosoma e di ciascuno si conosce esattamente la
posizione cromosomica i marcatori più informativi
sono quelli che presentano un elevato grado di
eterozigosità, perché questo consente di
distinguere lallele paterno dallallele materno
La nomenclatura D20S906 indica che un marcatore
di DNA è singolo nel genoma ed è localizzato sul
cromosoma 20 purtroppo il numero 906 non ha
alcun rapporto con la posizione
38
Marcatori polimorfici

• A partire dagli anni 80
• RFLP restriction fragment length polymorphisms
• Nella accezione attuale, il DNA purificato è
  amplificato con la PCR.
• Il prodotto della PCR è quindi tagliato in
  frammenti di restrizione mediante enzimi di
  restrizione detti endonucleasi, che attuano il
  taglio unicamente in corrispondenza di
  particolari sequenze nucleotidiche, specifiche
  per ogni enzima.
• I frammenti di restrizione sono separati per
  lunghezza mediante elettroforesi su gel d'agarosio

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RFLP

• lenzima di restrizione SmaI taglia
  lesanucleotide CCCGGG. La sequenza CCGGGG rende
  non digeribile il DNA in quella posizione

40
STR

• A partire dal 1990
• STR short-tandem repeats or microsatellites
• e.g. (CAn)
• gttatcttagggctcagtcacacacacacacacacacacatccaggtat
  tggatcaac
• Quello che varia tra gli alleli è il numero di
  ripetizioni dellelemento. E molto più frequente
  riscontrare individui eterozigoti, con un numero
  di ripetizioni differente nei due alleli

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SNPssingle nucleotide polymorphisms

• Variazioni puntiformi della sequenza tra due
  copie del genoma
• Per un SNP un individuo può essere
• Omozigote T/T o C/C
• Eterozigote T/C

42
ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCG
ACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCA
CACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACG
TAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTG
AAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGT
GCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACAC
ACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACC
GCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGG
GCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAAC
AGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTA
GCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACAC
AGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTC
GAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTC
TCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCT
CCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGA
TATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGA
CACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTC
CTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATAT
AGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTG
ACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA
GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACA
GCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCT
CGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCG
CTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCT
GACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAG
ACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGAACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAG
GGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAA
CAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCT
CGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCT
CTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGC
TCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCT
AGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA
TATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAG
ACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCT
GACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATAT
AGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACAC
AGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTC
TCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGC
GCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACC
TGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCT
CGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCT
CGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGA
GACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTC
CCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGAC
ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCG
ACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCA
CACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAG
ACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACA
CGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGA
CACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCAC
ACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGT
AGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTG
CTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCG
CTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGCGAGACGT
AGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTG
CTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCG
CTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGG
CTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACA
GCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAG
CTAGCTCCTCTCGAGACGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTA
GGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAA
ACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAG
CTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCC
GACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGC
TCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTG
ACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGC
TCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGC
TCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCG
AGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCT
CCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGA
CACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGC
GACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGC
ACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGAC
GTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCT
GAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACG
TGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACA
CACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACAC
CGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAG
GGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAA
CAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACAC
ACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACC
GCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGG
GCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGA
TATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGA
CACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAG
GGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAA
CAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCT
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGAT
ATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGAC
ACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCC
TCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATA
TAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACA
CAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGG
CTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATTATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCT
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTTATAG
CTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGA
CACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCAC
ACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGA
CGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCC
TGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACAC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA
GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACA
GCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCT
CGAGACGTAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATA
GCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGATAGCT
AGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA
TATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAG
ACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGC
TCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGC
TCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCG
ACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGC
GCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACC
TGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCT
CGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCT
CGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCC
GACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGC
TCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTG
ACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGC
TCGCCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAC
GAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCG
CGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCG
CACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGA
CGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCC
TGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACAC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTA
GGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAA
ACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAG
CTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGA
Variazioni della sequenza del DNA
43
SNPs nel genoma umano http//www.ncbi.nlm.nih.gov
/SNP/ DB SNP built 128 (23 Oct 2007) Totale
11.751.216 Totale codificanti 111.003 Codif
icanti sinonimi 46.621 Codificanti nonsinonimi
64.382
44
Aploblocchi sul sito http//www.hapmap.org
45
DNA recombination
22 1
22 1
A -
NR
(?)
B -
A -
- A
chr1
2 (22 1)
2 (22 1)
B -
- B
?
- A
Meiosis
R
chr1
(?)
(?)
?
?
- B
A -
A -
- A
- A
chr1
B -
B -
- B
- B
A -
R
chr1
chr1
chr1
chr1
(?)
A -
- A
B -
chr1
Diploid gamete precursor cell
B -
- B
- A
chr1
NR
- B
Haploid gamete precursors
chr1
Hap. gametes
46
ricombinanti R e non ricombinanti NR il 50 deve
essere R e il 50 NR se i loci sono posti su
cromosomi differenti, mentre i NR sono gt50 se i
loci sono sintenici.
47
Lanalisi della frazione di ricombinazione è alla
base del mappaggio

• la frazione di ricombinazione tra due loci, q, è
  compresa tra 0 e 0.5
• Il valore di q non può mai essere maggiore di
  0.5, il che indica che i loci sono posizionati
  molto lontani o su cromosomi differenti
• se q è significativamente minore di 0.5 i loci
  sono linked
• più piccolo è q più vicini sono i loci

48
(No Transcript)
49
lunità di misura della distanza genetica è il
centiMorgan cM

• La distanza genetica tra due loci è il numero
  atteso di crossovers per meiosi
• le distanze piccole sono accurate mentre le
  grandi sono sottostimate perché un doppio
  crossover può far pensare a un non ricombinante
• per valutare distanze grandi occorre sommare
  distanze piccole
• per q lt10 la correlazione tra q e cM è 11
• mediamente 1 cM corrisponde a circa 850.000 bp,
  ma tale valore è inversamente proporzionale alla
  frequenza di ricombinazione

50
Le meiosi si visualizzano con MLH1 che è parte
del macchinario di ricombinazione Nella meiosi
maschile che avviene nei testicoli ci sono circa
51 chiasmi e quindi considerando 50cM per
chiasma, il genoma è di 2550 cM Nella meiosi
femminile che è più difficile da studiare perché
avviene a 16-24 settimane di vita fetale ci sono
almeno 70 chiasmi (3500 cM), ma si stimano
4280cM Dal momento che la frequenza di
ricombinazione è differente si usa un valore
medio tra i due sessi
51
Il mappaggio per linkage è basato sullanalisi
della ricombinazione
affetto
non affetto
Locus malattia
Marker
D allele patologico d allele wild-type
52
1 obiettivo - stabilire la fase
Doppio eterozigote
53
2 obiettivo contare i ricombinanti
NR NR NR NR NR R
54
lod-score

• Il lod-score misura le probabilità a favore del
  linkage
• Compara la probabilità ad un certo valore di ? e
  la probabilità nel caso non vi sia alcun linkage
  e quindi che ? sia uguale a 0.5
• LOD log of the odds Z(?) log10 L(?)/L(0.5)

55
3 obiettivo calcolare il LOD score
NR NR NR NR NR R
LOD SCORE (LOD)
Z log10 ? R ( 1- ?) NR
log10 ? ( 1- ?) 5
0.5 6
0.5 (RNR)
56
Il metodo

• La probabilità L(q) è calcolata per i differenti
  valori di q tra 0 e 0.5
• Un rapporto tra le probabilità è calcolato LR(q)
  L(q)/L(0.50)
• Il lod-score è il logaritmo in base 10 (log10)
  del rapporto tra le probabilità
• Z(q) log10L(q)/L(0.50)
• La migliore stima della frazione di
  ricombinazione è il valore di q a cui Z(q) è
  massimo (MLS)

57

• Per le patologie a trasmissione mendeliana
• Z(?) gtgt 3 ? si accetta il linkage per un
  carattere autosomico
• Z(?) gtgt2 ? si accetta il linkage per un carattere
  X-linked
• Z(?) lt -2 ? si respinge definitivamente lipotesi
  di linkage per un particolare valore di ?
• Z(?) gt -2 ma lt 3 ? occorrono ulteriori studi

58
linked, no recombination
59
Link utile
http//linkage.rockefeller.edu