Glicogenosi tipo 1a: trasferibilit

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Glicogenosi tipo 1a trasferibilità dei dati
sperimentali al trattamento del paziente
Luigi Varesio

• AIG Rimini 2010

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Dal laboratorio alla clinca

• Fase 1
• Sperimentazione in vitro e su modelli animali
• preparazione dei reagenti per lutilizzo
  sulluomo
• Fase 2
• Approvazione del protocollo dai comitati etici
  (Ospedale, Ministero della Sanità)
• Certificazione dei reagenti per sperimentazione
  sulluomo
• Fase 3
• Sperimentazione della terapia sul paziente

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Terapia cellulare GSD1a
Trapianto di epatociti
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TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Insufficienza epatica acuta TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Insufficienza epatica acuta TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Insufficienza epatica acuta TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Insufficienza epatica acuta
Causa (N pazienti trattati) outcome
Droghe (19) 14 deceduti 2 trapiantati 3 guariti
Infezione virale (9) 6 deceduti, due trapiantati, 1 guarito
Insufficienza epatica acuta idiopatica (6) 2 deceduti, 3 trapiantati, 2 guariti
Avvelenamento da funghi (1) Guarito
Insufficienza epatica acuta idiopatica post-operatoria (1) Deceduto
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TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Malattie Metaboliche TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Malattie Metaboliche TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Malattie Metaboliche TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Malattie Metaboliche
malattia (Npazienti) Risultati al follow up outcome
Crigler-Najjar (9) Miglioramento dei parametri metabolici Tutti trapiantati (ecceto uno) da 4 mesi a 4 anni dal trattamento
Ipercolesterolemia familiare (5) Miglioramento dei parametri metabolici NA
Deficienza del fattore VII (2) Riduzione della richiesta del fattore VII dell70 per 6 mesi Trapianto dopo 7-8 mesi
Glicogenosi tipo 1a (2) Miglioramento dei parametri metabolici NA
Colestasi intraepatica familiare (2) Nessun beneficio Trapianto dopo 5-14 mesi
Deficienza di OTC (6) 4 pazienti con miglioramento dei parametri metabolici. 2 pazienti deceduti 4 pazienti trapiantati da 4 a 7 mesi dal trattamento
Deficienza di ASL (1) Miglioramento dei parametri metabolici Trapianto dopo 18 mesi
Deficienza di CPS1 (1) Miglioramento dei parametri metabolici In attesa di trapianto dopo 11 mesi dal trattamento
Citrullinemia (1) Miglioramento dei parametri metabolici NA
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TERAPIA CELLULARE NEL FEGATO STAMINALI
Sperimentazione nel topo
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(No Transcript)
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Ripopolazione del fegato con cellule staminali
ematopoietiche ottenute da vari ceppi di topi
topi Rosa-26
topi Rosa-26
topi Rosa-26
b-gal
anti-b-gal
controllo anti-b-gal
a-GFP
a-Alb
Topi GFP
Topi GFP
Topi GFP
Istochimica per attività G6Pasi
FISH
Fluorescenza GFP
epatocita
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Il trattamento con cellule staminali aumenta la
sopravvivenza dei topi glicogenotici
Non trattati Trattati v.t. Trattati i.f. Trattati
i.e.
vivi
Giorni dal trattamento
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Trapianto di cellule ematopoietiche staminali
CONCLUSIONI Cellule ematopoietiche staminali
possono essere importanti per correggere i
difetti enzimatici del fegato di pazienti con
Glicogenosi di tipo 1a
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CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATO Cirrosi epatica CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATO Cirrosi epatica CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATO Cirrosi epatica CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATO Cirrosi epatica CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATO Cirrosi epatica
Paese N pazienti Tipo di cellule infuse Risultati ottenuti al follow-up follow-up (mesi)
Italia 8 mobilitazione con G-CSF1 Miglioramento parametri clinici 8
Giappone 9 Staminali derivate dal midollo Miglioramento parametri clinici 6
Iran 4 Staminali ematopoietiche derivate dal midollo Nessun miglioramento parametri clinici 6
Iran 4 Staminali mesenchimali derivate dal midollo Miglioramento parametri clinici 12
Brasile 10 Mononucleate totali Nessun miglioramento parametri clinici 4
Brasile 30 Mononucleate totali Miglioramento parametri clinici 3
Grecia 2 Mononucleate totali Miglioramento parametri clinici 12
Inghilterra 5 CD34 dopo adesione su plastica2 Miglioramento parametri clinici 12
Germania 6 CD133 Miglioramento parametri clinici NA
Germania3 13 CD133 Miglioramento parametri clinici NA
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I DIECI PRINCIPI DELLE GOOD MANUFACTURING
PRACTICE LE NORMATIVE EUROPEE
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Cell factory
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• LA GESTIONE DEL SISTEMA DI QUALITÀ
• Il personale
• -Le figure indispensabili- Qualified Person-
  Responsabile Produzione-Responsabile Controllo
  Qualità
• La documentazione La gestione della
  documentazione Le standard operating
  procedures I protocolli
• Il change control
• Le deviazioni
• Out of  specification e out of trend nei
  laboratori di controllo qualità
• La gestione delle azioni correttive e preventive
• I reclami ed i richiami
• Le auto ispezioni
• La certificazione dei lotti

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• LA PRODUZIONE
• Descrivere i flussi dei materiali in conformità
  alle normative GMP
• Descrivere i flussi di processo in conformità
  alle normative GMP
• Gli ambienti e le apparecchiature
• I sistemi di condizionamento
• Le utilities Acqua Vapore Gas ecc
• La qualifica e le sue fasi
• La convalida di processo
• Il mantenimento dello stato di qualifica e
  convalida Calibrazione Manutenzione
  Riqualifica

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• IL CONTROLLO QUALITÀ
• Ruoli e competenze
• Le attività di laboratorio Metodi di analisi
  La qualifica della strumentazione La convalida
  dei metodi di analisi
• lL campionamento
• LE GESTIONE DELLE ATTIVITÀ A CONTRATTO
• Il Technical/Quality Agreement
• La qualifica del fornitore

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La glicogenosi 1a può essere associata ad uno
stato infiammatorio
Necrotic foci, elevated chemokines and
infiltrating neutrophils in the liver of glycogen
storage disease type Ia. Kim DY et al, J
Hepatol. 2008
18
Glicogenosi tipo 1a

• Complicazioni
• mancata crescita
• ritardo puberta
• gotta giovanile
• pancreatite
• arteriosclerosi
• epatoma
• ipertensione
• adenoma
• malattie renali

• Manifestazioni cliniche
• epatomegalia
• ipoglicemia
• iperuricemia
• iperlipidemia
• ritardi di crescita

Infiammazione
Che cosa causa linfiammazione?
Citochine IL-6, IL-8
19
Il gene della sindrome Von Hippel Lindau (VHL)
20
Hypoxia causes inflammation

• Years ago
• 3.8 billion? first procariotic fossil
• 2.0 billion ?photosynthetic organisms
• Oxygen captured by ferrous iron
• Earth rusted
• 1.8 billion? first eucariotic organism
• Hypoxic Atmosphere (1 oxygen)
• 0.6 billion? animal evolution
• Normoxic Atmosphere ( 20 oxygen)

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HIF-1 Pathway

x
No VHL
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Hypoxia in patho-physiological processes
Growing tumors
Myocardial ischemia
Cerebral ischemia
Energy metabolism
Diabetic retinopathy
Pulmonary hypertension
Cell survival
Angiogenesis
HYPOXIA (pO2 0-20mm Hg)
Rheumatoid arthritis
Wound healing
Erytropoiesis
Cell migration
Cell proliferation/ survival
Aherosclerosis
Microbial infections
Preeclampsia
Intrauterine growth retardation
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Ipossia
Glicogenosi 1a
Cè ipossia nel fegato glicogenotico?
24
Il mondo dell omica
25
(No Transcript)
26
The chip
54000 probsets
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PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA IN GSD1a

• Analisi tramite tecnologia microarray del
• Profilo di espressione genica nel fegato di TRE
  pazienti GSD1a trapiantati rispetto a TRE
  soggetti normali
• Bibliosphere (Genomatics) nuovo programma per
  analizzare le vie metaboliche modificate nei
  tessuti

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Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a

NAME
23 GENI OXP
HYPOXIA_REG_UP
LINES_MYC_LEA
NB-HYPO_32 GENES
L1L2_11PBST
HYPOXIA_RCC_NOVHL_UP
L1L2_M-
VHIF1_Q3
HYPOXIA_NORMAL_UP
HIF1_TARGETS
L1L2_M
TRP_U133
HYPOXIA_REVIEW
VHIF1_Q5
HYPOXIA_RCC_UP
LEA_C1_SET_TOP
NAME
HSA00190_OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION
HSA00330_ARGININE_AND_PROLINE_METABOLISM
HSA01040_POLYUNSATURATED_FATTY_ACID_BIOSYNTHESIS
HSA00272_CYSTEINE_METABOLISM
HSA00360_PHENYLALANINE_METABOLISM
HSA00010_GLYCOLYSIS_AND_GLUCONEOGENESIS
HSA00020_CITRATE_CYCLE
HSA00910_NITROGEN_METABOLISM
HSA00252_ALANINE_AND_ASPARTATE_METABOLISM
HSA00030_PENTOSE_PHOSPHATE_PATHWAY
HSA04610_COMPLEMENT_AND_COAGULATION_CASCADES
HSA00220_UREA_CYCLE_AND_METABOLISM_OF_AMINO_GROUPS
la glicogenosi 1a causa ipossia del fegato
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O2
30
Che cosa provoca queste risposte?
LIPOSSIA DEL FEGATO
Necrotic foci, elevated chemokines and
infiltrating neutrophils in the liver of glycogen
storage disease type Ia. Kim DY et al, J
Hepatol. 2008
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Glicogenosi tipo 1a

• Complicazioni
• mancata crescita
• ritardo puberta
• gotta giovanile
• pancreatite
• arteriosclerosi
• epatoma
• ipertensione
• adenoma
• malattie renali

• Manifestazioni cliniche
• epatomegalia
• ipoglicemia
• iperuricemia
• iperlipidemia
• ritardi di crescita

Infiammazione
Che cosa causa linfiammazione?
LIPOSSIA DEL FEGATO
Citochine IL-6, IL-8
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Quali sono le criticità?
BIOBANCHE!!
raccolta dei campioni e diffuione dei risultati
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Biobanca Integrata Tessuto-genomica (BIT) Gaslini
Pazienti
Trattamento
Classificazione Patologia Diagnosi
Strutture DNA Espressione Genica RNA regolatori
BIT

• Clinica
• Fattori Prognostici
• Indicatori risposta

• Ricerca
• Data mining
• Biomarcatori
• Vie Metaboliche

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Biobanca Digitale Europea (DiBi) aggrega varie
BIT
Centralizzazione dellinformazione e nondei
tessuti/sieri
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Collaboratori
Associazione Italiana Glicogenosi

• Biologia Molecolare Gaslini
• R. Lavieri
• A. Eva
• P. Fardin
• R.Resaz
• L. Varesio

• Reparti Clinici
• Dr. M. Di Rocco
• G.Gaslini Institute (Genova)
• Dr. D. Melis
• Federico II University (Napoli)
• Dr. R.Parini
• S.Gerardo Hospital (Monza)
• Dr. S. Paci
• S.Paolo Hospital (Milano)
• Dr. E. Procopio
• Meyer Hospital (Firenze)
• Dr. C. Dionisi
• Bambin Gesù Hospital (Roma)

• IST Genova
• O. Barbieri

• National Institutes of Health (USA)
• J.Chou
• D. Munroe
• S.K. Arya

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Haematopoietic stem cells
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Hematopoiesis in the red bone marrow
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MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A In preparazione MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A In preparazione MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A In preparazione MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A In preparazione
Modello animale Caratteristiche Costruttore
Topi condizionali Knock-out (SV40-CRE) Chou, J. (pubblicato)
Topi condizionali Delezione della G6Pasi solo nel rene Chou, J. (nessuna informazione)
Topi condizionali Knock-out (CMV.CRE) Varesio. I knock-out muoiono tutti alla nascita
Topi condizionali Delezione della G6Pasi solo nel fegato Varesio. Stanno nascendo i primi topi
Topi condizionali ??? Fabienne RAJAS Gilles Mithieux. Nessuna informazione Nulla di pubblicato.
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MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A Utilizzati finora MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A Utilizzati finora MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A Utilizzati finora MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A Utilizzati finora
Modello animale Tipo di terapia utilizzata Risultati Costruttore
Topo knock-out Adenovirus Controllo parziale della patologia per breve tempo Chou, J.
Adenovirus adenoassociato Controllo parziale della patologia per medio tempo con miglioramento anche sul rene Chou, J.
Adenoassociato di nuova costruzione Controllo completo della malattia Chou, J.2
Cane knock-out1 Modello animale spontaneo per la GSD-Ia. Adenoassociato Controllo parziale della patologia Koeberl DD (NC)3
Cane knock-out Modello animale spontaneo per la GSD-Ia. Adenoassociato Controllo parziale della patologia Mah CS (FL) 4 e Chou, J