Diapositiva 1

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• Cosè la terapia genica
• Per terapia genica si intende l'introduzione di
  un gene che ha come effetto quello di prevenire o
  correggere una condizione patologica.
• Tipi di terapia genica
• Somatica
• Manipolare lespressione genica in cellule del
  paziente, permettendo di trasferire tale
  mutazione alla progenie
• Germinale
• modificare geneticamente le cellule germinali per
  trasferire il cambiamento alla progenie

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Strategie terapeutiche

• Compensare una mutazione che causa la perdita di
  una funzione cellulare
• (sostituzione del gene perso o difettivo) ad
  esempio in patologie autosomiche recessive o
  autosomiche dominanti caratterizzate da
  aploinsufficienza)

• Sostituire/inattivare una mutazione negativa
  dominante
• (sostituire il gene dominante nel suo locus o
  degradare selettivamente il suo RNA)

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Strategie terapeutiche

• Uccisione diretta di cellule patologiche (in
  genere tumorali)

• Uccisione di cellule patologiche mediata dal
  sistema immunitario (tumori)

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• Il vettore
• Per trasferire il transgene nella cellula
  bersaglio è necessario disporre di un sistema in
  grado di veicolarvi allinterno il DNA, cioè un
  VETTORE.
• Un vettore efficiente deve
• Essere selettivo
• Entrare facilmente nelle cellule-target
• Essere esprimibile in elevate quantità
• Essere sicuro
• Esistono due grandi categorie di vettori che
  consentono il trasferimento genico
• Vettori non virali si basano sulluso di DNA,
  da solo o complessato a molecole che ne
  facilitino lingresso nella cellula.
• Vettori virali si basano sullutilizzo di virus
  opportunamente modificati in modo tale da poter
  veicolare il loro genoma allinterno delle
  cellule bersaglio, senza dare malattia.

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VETTORI VIRALI

• I virus hanno un'ottima tendenza ad infettare le
  cellule ed ad inserirvi il proprio DNA sia
  integrandolo sia sotto forma d'episoma.
• Rispetto ai sistemi di trasferimento non virali,
  quindi, hanno un'efficienza nettamente maggiore.
• I virus attualmente studiati quali vettori per
  la terapia genica sono
• Retrovirus
• Adenovirus
• Virus AdenoAssociati
• Si ottengono inserendo il gene di interesse nel
  genoma di diversi tipi di virus, sotto il
  controllo di un promotore forte.
• Il virus viene reso incapace di riprodursi
  autonomamente, per evitare la diffusione
• di virus ricombinanti (virus difettivo). A tal
  scopo molti geni virali dei vettori sono rimossi
  e sostituiti dal gene bersaglio e da elementi
  regolatori

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Clonaggio con doppia digestione
pShuttle
pShuttle
DNA ligasi
DNA ligasi
DNA ligasi
DNA ligasi
pShuttle Gene target
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Vettori virali

• Virus difettivi possono essere prodotti solo
  grazie a particolari linee cellulari capaci di
  complementare i difetti del virus. La loro
  preparazione deve seguire queste fasi obbligate
• Costruzione del genoma ricombinante
• 2. Trasfezione del DNA nella linea cellulare
  capace di
• produrre le particelle virali (linee di
  packaging)
• 3. Raccolta e analisi del virus

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Vettori virali caratteristiche principali

• Retrovirus Sono stati i primi virus ad essere
  studiati per la terapia genica. Possono infettare
  solo cellule in divisione e si integrano
  stabilmente in maniera casuale.
• Lentivirus derivati del virus dell'HIV,
  possono infettare cellule quiescenti e si
  integrano stabilmente in maniera casuale.
• Adenovirus Sono espressi ad alti livelli, non
  si integrano stabilmente e danno grosse reazioni
  immunitarie.
• Virus adeno-associati (AAV) integrazione sito
  specifica ed espressione stabile nel tempo,
  difficile produrli ad alto titolo. Non causano
  patologie.

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Retrovirus

• I retrovirus presentano due filamenti di RNA
  complessati con varie proteine, un capside ed un
  involucro lipidico (envelope). Possiedono una
  funzione di trascrittasi inversa, capace di
  sintetizzare una forma di DNA complementare che
  può integrarsi nel DNA cromosomico.

• Il genoma tipico contiene tre geni
• gag codifica per le proteine strutturali
• pol codifica per gli enzimi trascrittasi
  inversa,
• proteasi e integrasi
• env codifica per le proteine di membrana
• Psi (?) Sequenza necessaria per il packaging
  (impacchettamento)

• Ad ognuna delle due estremità esiste un segmento
  di DNA, formato dalle unità ripetitive terminali
  o LTR.
• Queste unità LTR agiscono come promoter,
  regolando lespressione dei geni virali ed
• inoltre permettono al virus di integrare il
  proprio genoma entro i cromosomi delle cellule
  infettate.
• I vettori retrovirali possono veicolare inserti
  di DNA lunghi sino a 8kb.

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Ciclo vitale di un Retrovirus

• Il retrovirus si lega a specifici recettori
  situati sulla membrana cellulare della cellula
  ospite (il recettore CD4 della superficie
  cellulare e recettore delle chemochine a sette
  domini transmembrana associato a G protein).
• Si ha quindi la fusione dellinvolucro lipidico
  virale con quello della cellula, e il virus
  viene rilasciato nel citoplasma e lRNA viene
  liberato
• dallinvolucro capsidico.
• Lenzima trascrittasi inversa converte lRNA
• in DNA a doppio filamento nel citoplasma
• della cellula infetta.
• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene
• integrato nel DNA della cellula ospite
• mediante lenzima integrasi prodotto
• dal virus. Il DNA integrato è chiamato
• provirus.
• Lapparato della cellula ospite trascrive
• il provirus producendo RNA virali che saranno
• incapsidati nei nuovi virioni.

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Vettori retrovirali difettivi per replicazione
Linea cellulare di packaging Fibroblasti 3T3
murini
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Lentivirus

• I Lentivirus sono una sotto-classe di retrovirus
  di cui condividono la morfologia ed il ciclo
  replicativo ma a differenza dei precedenti,
  possono infettare ed integrarsi anche in cellule
  quiescenti
• Hanno una struttura più complessa
• oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma
  contiene due geni regolatori , tat e rev
  essenziali per il controllo dellespressione
  genica, ed un numero variabile di geni accessori.
• Derivano dal virus dell'HIV opportunamente
  modificato per garantire la sicurezza del
  ricevente.

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I Retrovirus nella terapia genica

• Vantaggi
• Il DNA del vettore si integra stabilmente nel
  genoma
• Il gene terapeutico viene trasmesso alle
  cellule figlie in seguito a divisione cellulare.
• Limiti
• Linfezione delle cellule richiede la
  replicazione cellulare, cosa che esclude il loro
  utilizzo nella cura delle patologie che
  interessano i tessuti non in divisione come
  quelle del sistema nervoso.
• Si integrano nel genoma cellulare in modo
  relativamente casuale, provocando inserzioni
  mutageniche con potenziale danno alle cellule
• La loro produzione è estremamente costosa
• La semplice iniezione dei vettori retrovirali
  non è sufficiente per una terapia genica in vivo,
  perchè essi vengono uccisi dal sistema
  Immunitario umano mediante l'attivazione del
  complemento.

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Adenovirus

• Ladenovirus è un patogeno naturale delluomo
  con un genoma a DNA a doppio filamento.
• Ad oggi se ne conoscono ben 51 sierotipi, in
  grado di infettare 6 diverse specie, causando
  unampia gamma di patologie diverse, da malattie
  respiratorie a congiuntiviti, a gastroenteriti.
• I vettori adenovirali possono essere prodotti
  con titoli elevatissimi e solitamente accettano
  inserti grandi sino a 7-8kb.
• L'ingresso nelle cellule avviene mediante
  endocitosi mediata da recettori,
• ma il DNA inserito non sembra integrarsi e quindi
  l'espressione dei geni inseriti può essere
  mantenuta solo per brevi periodi.
• Può infettare molti tipi di cellule

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Struttura

• Tutti gli adenovirus hanno una simmetria
• icosaedrica

• Essi sono composti da 252
• capsomeri di cui 240 esoni
• e 12 pentoni al vertice dellicosaedro

• Una glicoproteina (Fibra) protrude dal centro del
  pentone. Essa è responsabile dellattacco del
  virus al recettore della cellula ospite.

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Genoma
Il genoma degli adenovirus è apprissimativamente
di 36 kb Sono individuabili regioni codificanti
per geni espressi precocemente (early, E) e
tardivamente (late, L). Ai due lati del
genoma si trovano le cosiddette sequenze
terminali invertite (ITR, Inverted Terminal
Repeat) le quali sono necessarie per la
replicazione del virus. Nel nucleo cellulare
vengono espressi per primi i geni E1 (detti
precoci immediati) che permettono la
transattivazione dei geni E2 ed E4 che
determinano il blocco della sintesi proteica
cellulare e partecipano alla replicazione del DNA
virale. Una volta che è iniziata la
replicazione, vengono attivati i geni tardivi che
codificano per le proteine strutturali che nel
nucleo cellulare si assemblano intrappolando il
DNA dell'adenovirus virale.
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Ciclo vitale di un Adenovirus

• Il legame delladenovirus alla superficie
  cellulare avviene in due fasi
• - Le proteine della fibra virale interagiscono
  con il recettore CAR
• (recettore degli adenovirus coxsackie).
• - La regione RGD del pentone interagisce con
  alcune integrine di membrana (?5?3 o ?5?5)
• Il legame promuove
• linternalizzazione per
• endocitosi mediata da
• recettore in una vescicola
• ricoperta da clatrina.
• Il virus lisa la vescicola
• endosomiale
• il capside rilascia il genoma
• a DNA nel nucleo.

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VETTORI ADENOVIRALI

• Inserimento del gene terapeutico mediante
  ricombinazione omologa
• (quantità massima di DNA trasportato 8 kb)
• Gli adenovirus ricombinanti usati come vettori
  presentano una delezione almeno della regione E1
  il che rende il virus difettivo per la
  replicazione

ricombinazione
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VETTORI ADENOVIRALI
Generalmente gli adenovirus ricombinanti
presentano una delezione sia della regione E1
che di quella E3. Si è visto, però, che talune
cellule infettate da questo vettore esprimono i
geni rimanenti in quantità basse, ma sufficienti
ad evocare una risposta citotossica in grado
d'eliminarle. Studi successivi hanno permesso
d'ottenere vettori ricombinanti aventi anche una
delezione delle regioni E2 o E4 ma ciò ha
determinato una riduzione dell'espressione
genica.
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VETTORI ADENOVIRALI HD
Attualmente si è ottenuta una terza generazione
di vettori ricombinanti (Helper Dependent o
anche high Capacity) in cui tutti i geni virali
sono stati eliminati e sono rimaste solamente le
regioni ITR e la sequenza di packaging a fianco
del gene d'interesse. La produzione di questo
tipo di virus utilizza cellule trasfettate
stabilmente con E1 ed una ricombinasi chiamata
CRE, che è in grado di tagliare il segnale di
impacchettamento del virus helper contente tutti
i geni virali tranne E1, e che ha la funzione di
provvedere alla trascrizione di tutte le proteine
del capside del vettore helper dependent. Il
virus helper al contrario non può impacchettarsi
in quanto mancante del segnale di
impacchettamento poiché exciso dalla proteina
CRE.
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Gli Adenovirus nella terapia genica
Vantaggi Largo numero di tipi cellulari
bersaglio ed alta efficienza . Non richiede
che la cellula ospite sia in divisione. Il DNA
virale esiste come episoma e non si incorpora
stabilmente nel genoma delle cellule bersaglio,
eliminando così il rischio di cancerogenesi. Li
miti Rapida inattivazione delle cellule
infettate dalladenovirus. Avviene una
progressiva perdita dellepisoma che porta
generalmente ad una espressione transitoria.
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Virus Adeno-associato (AAV)

• I virus adeno-associati sono virus umani non
  patogeni che appartengono alla classe dei
  parvovirus (piccoli virus a DNA a singolo
  filamento).
• Il virione è molto piccolo e privo di un
  involucro lipidico.
• Le ridotte dimensioni del virione non permettono
  linserimento di DNA esogeno di lunghezza
  superiore a 4 Kb e questo comporta notevoli
  limitazioni al loro utilizzo.
• Ad oggi ne sono stati descritti 11 sierotipi, in
  grado di infettare cellule di diversi tessuti,
  anche non attivamente proliferanti.

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Struttura
Il loro genoma è costituito da un singolo
filamento di DNA costituito da due geni Rep
che codifica per le proteine implicate nella
replicazione e nell'integrazione Cap per le
proteine del capside. A ciascuna estremità vi è
una sequenza regolatoria terminale ripetuta, ITR
(inverted terminal repeats), di 145bp contenente
un promotore.
Quando tale virus viene utilizzato come vettore,
i due geni rep e cap vengono sostituiti con il
gene di interesse e le regioni regolatrici ad
esso correlate.
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Ciclo vitale di AAV
Gli AAV sono incapaci di replicare
autonomamente Il loro ciclo vitale richiede la
presenza di un virus di dimensioni superiori
(virus helper), quasi sempre un adenovirus o un
herpes virus. In assenza del virus helper, lAAV
si integra in una regione ben precisa sul
cromosoma 19 ed esprime i suoi geni a livelli
molto bassi, infettando la cellula in modo
latente. Se questa cellula viene poi infettata
da un virus helper, il genoma dellAAV viene
estratto dal DNA genomico e replicato, le
proteine virali vengono prodotte ad alti livelli,
avviene lassemblamento delle particelle virali e
il loro rilascio. Il vettore basato sui virus
adenoassociati ricombinanti è costruito
sostituendo il gene terapeutico a cap e rep. La
produzione d'un simile vettore la si ottiene
trasfettando una linea cellulare (HEK293) con un
plasmide contenente i geni cap e rep e
Successivamente infettandola con un adenovirus
helper difettivo per E1.
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I Virus AdenoAssociati nella terapia genica

• Vantaggi
• Non causano infiammazioni e non sono
  responsabili di nessuna patologia che colpisca
  luomo.
• Mancanza di reazioni immunitarie ? questi virus
  danno luogo ad un'espressione
• genica a lungo termine e con un elevato grado di
  sicurezza.
• Normalmente il virus non modificato si integra
  nel genoma della cellula bersaglio ad uno
  specifico locus del cromosoma 19, eliminando così
  il rischio di inserzioni casuali.
• Limiti
• Hanno una ridotta capacità a trasportare geni
  estranei (solo 4 kb, la metà rispetto agli
  adenovirus).