ADENOVIRUS

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ADENOVIRUS

• 1953 identificazione di un virus come causa del
  processo degenerativo di colture cellulari
  derivate da adenoidi umane
• 1954 dimostrazione di effetto citopatico in
  colture di tessuto infettate con secrezioni
  dellapparato respiratorio

1956 studi epidemiologici confermano lorigine
virale dellagente eziologico delle malattie
acute dellapparato respiratorio. Virus simili
causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili
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ADENOVIRIDAE
più di 100 membri
3
Adenovirus umani
 Sottogruppi Tropismo cellulare Sierotipi
A tratto GI 12,
18, 31 B polmoni, tratto urinario
3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 C
alte e basse vie dellapparato respiratorio 1,
2, 5, 6 D tratto GI, occhi
8,10, 13, 15, 17, 19, 20,
22,30, 32, 33, 36,39, 42,49, 51 E
tratto respiratorio 4
F-G tratto GI 40, 41
virus generalmente poco patogeni infezioni
lievi ed autolimitanti
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STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS
70-100 nm
Core ds DNA - covalentemente legato alla
proteina TP - complessato alla proteina VII
proteina X (proteasi) proteina V core
proteasi
Capside (252 capsomeri)
240 esoni trimeri di proteina II 12 pentoni
Base (pentameri di proteina III)
Fibra (trimeri di proteina IV)
70-90 nm
proteina IIIA esoni che circondano i
pentoni proteina IX esoni delle facce
proteina VI ancora lanello di esoni che
circondano ipentoni con il core proteina VIII
ancora gli esoni delle facce al core
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Il GENOMA degli ADENOVIRUS
(ds DNA 30-36 Kb)

regione ORI (replicazione del genoma)
regioni di controllo trascrizionale
siti di legame per fattori trascrizionali e
proteine enhancer cellulari NF-I e Oct-I
sequenza di impacchettamento
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Penetrazione di Adenovirus

• entrata mediata da endocitosi clatrina-dipendente
  
• Perdita delle fibre
• Lisi della membrana degli endosomi mediato dalla
  proteina della base dei pentoni
• A livello dei pori nucleari la struttura
  capsidica subisce un disassemblaggio parziale
• - perdita dei pentoni III e della
  proteina IIIa
• - dissociazione della proteina VIII
• - degradazione proteolitica della proteina
  VI da parte della proteasi presente nel virione
  (adenina)
• - perdita della proteina IX

pH
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PENETRAZIONE DEL GENOMA
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ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS
E- geni precoci L- geni tardivi
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I GENI PRECOCI
E1A/B
E2A/B
E3
E4
ITR
ITR
10
GENE E1A
mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R
trans-attivatori trascrizionali di geni virali e
cellulari

• progressione del ciclo cellulare
• - legame con pRb (Retinoblastoma tumor
  suppressor protein)

induzione di apoptosi - stabilizzazione di p53
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Ruolo di pRb nella regolazione della
proliferazione cellulare
12
p14
13
GENE E1A
mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R
trans-attivatori trascrizionali
Alterano la progressione del ciclo cellulare
Stimolano la replicazione del DNA virale

• Bloccano la risposta ci difesa cellulare
• inibizione di STAT1
• - inibizione di IKK

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Proteine E1B
55 kDa - lega, inibisce e induce la degradazione
di p53 19 kDa - omologo di Bcl2 (inibisce
oligomerizzazione di Bax

• Stabilizzazione, esporto e traduzione
  preferenziale dei trascritti virali.
• Inibizione della sintesi proteica della cellula
  ospite.

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MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE
CAR
integrine

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ESPRESSIONE GENICA
VA
ITR
E1A/B
E2A/B
E4
ITR
E3
L5
L1 L2 L3 L4
E2A - ssDBP) E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi
virale
replicazione del DNA trascrizione dei geni late
in sinergia con fattori trascrizionali
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ESPRESSIONE GENICA
VA
ITR
E1A/B
E2A/B
ITR
E3
E4
L5
L1 L2 L3 L4
proteine che regolano la risposta della cellula
ospite allinfezione
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ESPRESSIONE GENICA
VA
ITR
E1A/B
E2A/B
ITR
E3
E4
L5
L1 L2 L3 L4
proteine che regolano la trascrizione del virus e
promuovono lo shut-off della sintesi proteica
cellulare
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Virus-Associated (VA) RNA
1 o 2 trascritti lunghezza 200
basi codificati dalla Polimerasi III della
cellula ospite
VAI
VA
inibizione della dimerizzazione di PKR
- mantenimento della sintesi proteica
- inibizione delle difese anti-virali
20
CICLO DI REPLICAZIONE
21
REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza
Ori
La sequenza Ori sequenza ricca di AT per
facilitare lo srotolamento del DNA
localizzata vicino a regioni di legame di fattori
trascrizionali
(aumento dellefficienza di replicazione)
proteina TP legata al terminale 5 di ogni
filamento
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REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza
Ori
reclutamento della Polimerasi virale e della
proteina pre-TP sulla sequenza core
il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza
ausiliaria facilita la formazione del complesso
- la Polimerasi forma un legame fosfodiesterico
tra dCMP e pre-TP
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Replicazione del DNA
associazione Pol-pre-TP e
sintesi del filamento complementare
From Flint et al. Principles of Virology (2000),
ASM Press
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I geni intermedi o precoci-ritardati
gene IX proteina IX stabilizzazione del
capside virale gene IVa2 proteina IVa2
transattivazione del promotore dei geni L in
associazione con L1 52/55 ed E1A incapsidamento
del DNA virale nei capsidi neoformati
esone
trimeri di pIX
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ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI
VA
ITR
E1A/B
E2A/B
E4
ITR
E3
L5
L1 L2 L3 L4
unico trascritto viene processato per formare
circa 18 mRNA con estremità 5 identiche, divisi
nei 5 gruppi L
E1A
MLTF
L1 L2 L3 L4 L5
promotore MLP
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TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L
trasporto facilitato
blocco del trasporto di mRNA cellulari al
citoplasma
accumulo citoplasmatico di mRNA virali
E4orf6 (34KDa)
E1B 55KDa
NES
?
RNA binding
fattore cellulare
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TRADUZIONE PREFERENZIALE
nelle fasi tardive dellinfezione blocco della
sintesi proteica della cellula ospite
m7G
eIF4F
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TRADUZIONE PREFERENZIALE
tutti gli mRNA Late contengono una sequenza di
200 nucleotidi al 5 (tripartite leader) che
permette il ribosome shunting
L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIa L2 -
polipeptide III (base dei pentoni) L3 -
polipeptide II (esoni) e proteasi L4 -
polipeptide 100 kDa L5- polipeptide IV (fibre)
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Assemblaggio di adenovirus

• proteine singole (no poliproteina)
• ruolo critico della proteina L1
• (funzione scaffold ?)
• citoplasma
• - formazione dei trimeri di proteina II (esoni).
  Funzione essenziale della proteina L4.

nucleo
- formazione dei pentameri di proteina III
(pentoni) - formazione dei trimeri di proteina
IV (fibre)
formazione di capsidi vuoti
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(No Transcript)
31
RILASCIO DEL VIRUS
disaggregazione del citoscheletro della cellula
ospite (L3 proteasi) E3 - death protein
(meccanismo sconosciuto)
32
Adenovirus terapeutici
33
TERAPIA GENICA
introduzione del gene esogeno nella cellula
malata
espressione della proteina

• - correzione del difetto genetico
• trasformazione di pro-drug
• - blocco del processo tumorale

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Sistemi di veicolazione del DNA
Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei
sistemi di veicolazione
Meccanismi non virali liposomi polimeri
cationici elettropazione micro-iniezione

Meccanismi virali
ottima protezione del DNA buona efficienza e
specificità possibile rischio di infezione
reazioni immunitarie
buona protezione del DNA bassa efficienza,
nessuna specificità assenza di rischio e
di reazioni immunitarie
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infezioni lievisicurezza (assenza di
integrazione e/o oncogenicità)infezione di
cellule in divisione e restingfacile
manipolazione
ADENOVIRUS
VETTORI PER TERAPIA GENICA

• sicurezza
• alta infettività e selettività
• espressione sostenuta del gene terapeutico

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VETTORI ADENOVIRALI

• inserimento del gene terapeutico mediante
  ricombinazione omologa
• (quantità massima di DNA trasportato 2-3 kb)

ricombinazione
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293 cell
La produzione dei vettori adenovirali avviene
in cellule della linea cellulare HEK293)
E1A
E1B
nucleo
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VETTORI ADENOVIRALI

• - bassa efficienza di transfezione
• (le cellule transfettate - distrutte
  dallinfezione virale)
• bassa efficienza di espressione genica
• - potente risposta immunitaria
• un esito mortale
• (danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria
  scatenata dalle elevate quantità di vettore
  virale somministrato)

Attualmente non sono utilizzati in trials di
terapia genica nelluomo
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peròla sperimentazione continua
VETTORI ADENOVIRALI
40
VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA
loxP
Y
vettore navetta
transgene
promoter
VA
Y
E2A/B
ITR
E4
ITR
L1 L2 L3 L4
L5
genoma virale plasmidico
ricombinazione in cellule 293
VA
Y
ITR
E4
E2A/B
transgene
promoter
ITR
L5
L1 L2 L3 L4
taglio mediato da Cre
Y
E2B
ITR
transgene
ITR
promoter
41
La replicazione dei vettori adenovirali ad alta
capacità avviene in presenza di un costrutto
helper
VA
E2A/B
ITR
ITR
E4
L1 L2 L3 L4
L5
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Vantaggi infezioni lievisicurezza (assenza
di integrazione e/o oncogenicità)infezione di
cellule in divisione e restingfacile
manipolazione alta capacità (35 kbp)espressione
sostenuta del gene terapeutico (circa 80 giorni)
VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA
Limitazionicontaminazione da helper (in
produzioni su larga scala)bassa resascarsa
stabilità
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TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA
CAPACITA
Distrofia muscolare (sindrome di Douchen)
Fibrosi cistica
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ADENOVIRUS ONCOLITICI ADENOVIRUS Onyx - 015
(dl1520)

VA
ITR
E3
E4
ITR
E1A/B
E2A/B
L5
genoma Ad
L1 L2 L3 L4

• delezione di 827-bp nel gene E1B
• e parte della regione E3 (gp19K)

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ADENOVIRUS dl1520
replica solo in cellule difettive per p53
p53 è inattiva nel 50 dei tumori umani e nel
70 dei tumori della testa e del collo
trials clinici in fase III per carcinomi squamosi
della testa e del collo (somministrazione del
mutante virale nella massa tumorale)