Patogeneza%20reumatoidalnego%20zapalenia%20staw

1
Patogeneza reumatoidalnego zapalenia stawówrola
szpiku kostnego

• Wlodzimierz Maslinski
• Zaklad Patofizjologii i Immunologii
• Instytut Reumatologii
• Warszawa

2
Zdrowy staw RZS
Zdegradowana chrzastka kosc
chrzastka
Plyn stawowy RZS
Blona maziowa w RZS
Zdrowa blona maziowa Spoczynkowe
Aktywowane Granulocyty, limfocyty T, limfocyty
B, makrofagi komórki NK, plytki krwi
Aktywowane synowiocyty makrofagalne synowiocyty
fibroblastyczne, makrofagi, limfocyty T,
limfocyty B, komórki NK, tuczne, plazmatyczne,
angiogeneza
Synowiocyty makrofagalne Synowiocyty
fibroblastyczne
Modified from Panayi et al. NEJM, 2001344907-16
3
Obrzek szpiku i nacieki komórkowe w RZS
McQueen FM and Ostendorf B, ART 2006, 8222
4
Szpik kostny w zwierzecych modelach zapalenia
stawów

• Podczas wczesnych etapów kolagenowego zapalenia
  stawów (CIA) (przed objawami zapalenia stawów)
  obserwuje sie powiekszenie kanalów laczacych
  szpik ze stawami oraz migracje nimi komórek
  mezenchymalnych. Terapia anty-TNF blokuje te
  zjawiska.
• Marinova-Mutachieva et al. 2002, Arthritis Rheum
  46507
• Podczas adjuwantowego zapalenia stawów DNA z
  mykobakterii jest znajdowane w szpiku i
  sledzionie, ale nie w stawach.
• Ronaghy et al. J.Immunol. 2002, 16851
• 3. Zapalenie stawów indukowane antygenem moze
  byc przeniesione do zdrowych myszy przez
  przeszczep szpiku, co wskazuje na Kobayashi et
  al. J. Rheumatol. 2002, 291176
• 4. Efektywna prezentacja antygenu (kilkukrotnie
  lepsza niz w wezlach chlonnych) zachodzi w szpiku
  kostym M. Feuerer Nat
  Med 2003 1151-7

5
Szpik kostny w RZS

• Udzial podchrzestnego szpiku w RZS
• Bugatti et al. 2005, Arthritis Rheum 52 3448
• Obrzek szpiku kostnego w RZS
• McQueen and Ostendorf. Arthritis Res Therapy.
  2006, 8 222,
• Nadzerki kosci i obrzek szpiku kostnego
  odzwierciedlaja prawdziwe zapalenie szpiku w RZS
  
• Jimenez-Boj at al. Arthritis and Rheum. 2007,
  56 1118

6
Zagadnienia

• Mikrosrodowisko szpiku bogate w cytokiny
  prozapalne promuja dojrzewanie i aktywacje
  osteoklastów
• Subpopulacje limfocytów w szpiku kostnym rola
  IL-15?
• Komórki regulatorowe w szpiku kostnym
• Funkcjonalne receptory Toll-podobne (TLR) sa
  obecne na limfocytach B w szpiku kostnym

7
Elevated levels of TNFa in bone marrow plasma
from RA in comparison to OA patients
P0,04
OA
RA
Warnawin et al. in preparation
8
Elevated levels of IL-1ß in bone marrow plasma
from RA in comparison to OA patients
P0,03
OA
RA
Warnawin et al. in preparation
9
Increased levels of IL-15 in RA bone marrow
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)
10
Soluble gp130 blocks IL-6/IL-6R active complex
IL-6
IL-6
Active complex
sIL-6R
sgp130
gp130
IL-6/sIL-6R/sgp130 - inactivated complex
IL-6R
signaling
11
Levels of IL-6, sIL-6R and sgp130 in bone marrow
isolated from RA and OA patients
IL-6 sIL-6R sgp130
sgp130/IL-6 sgp130/sIL-6R
- RA
- OA

• Lower level of sgp130 in RA compensate less IL-6
  and sIL-6R than in OA
• Thus, IL-6/IL-6Ra system forms better
  microenvironment in bone marrow to activate
  asteooclasts in RA

12
RANKL, RANK and OPG regulates maturation,
activation and survival of osteoclasts
Receptor activator of NF-kB ligand - RANKL
Receptor activator of NF-kB RANK Osteoprotegeri
n - OPG
Adapted from Boyle WJ, et al. Nature 2003 423
337- 42.
13
Levels of soluble RANKL and OPG in bone marrow
plasma
OPG/RANKL ratio
OPG
RANKL
28000
200
800
P lt 0.001
P lt 0.001
n.s.
180
700
24000
160
600
20000
140
500
120
16000
OPG concentrations (pg/ml)
400
100
RANKL concentrations (pg/ml)
12000
80
300
8000
60
200
40
4000
100
20
0
0
0
RA
RA
OA
OA
RA
OA
Lower OPG/RANKL ratio in RA than in OA suggests
that osteoclast maturation/activation
microenvironment in RA bone marrow contributes to
faster bone degradation
Radzikowska et al. in preparation
14
Wnioski Podwyzszone poziomy cytokin
prozapalnych (TNF-a, IL-1 beta, IL-6, IL-15,
IL-17) oraz wyzszy stosunek RANKL/OPG stwarza w
szpiku kostnym mikrosrodowisko promujace
zapalenie i degradacje kosci
15
Limfocyty T w szpiku kostnym w RZS
16
Increased absolute T cell number and CD4/CD8
ratio in rheumatoid arthritis (RA) bone marrow in
comparison to osteoarthritis (OA)
B
A
14000
14000
14000
14000
plt0.008
plt0.004
12000
12000
12000
12000




10000
10000
10000
10000
Number of CD3 cells/ml of bone
marrow
8000
8000
8000
8000
CD3CD4 /CD3CD8 ratio
6000
6000
6000
6000
4000
4000
4000
4000
2000
2000
2000
2000
0
0
0
0
RA
OA
RA
OA
C
plt0.05
ESR
R - 0.54
Number of CD3 cells/µl of RA bone marrow
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)
17
Increased expression of early activation marker
CD69 on RA bone marrow CD4 and CD8 T-cells
C
A
7
7
Plt0.05


6
6


Plt0.005
5
5
4
4
CD3CD4CD69 ()
3
3


2
2
1
1
0
0
-
1
-
1
RA BM RA PB OA BM OA PB
B
D
20
20
Plt0.01


18
18


Plt0.005
16
16
14
14
12
12
10
10
CD3CD8CD69 ()
Plt0.005
8
8


6
6
4
4
2
2
0
0
-
2
-
2
RA BM RA PB OA BM OA PB
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)
18
Proliferation of bone marrow T cells triggered by
IL-15
RA CD3 CD4
RA CD3 CD8
RA CD3

CD4
RA CD3

CD8

CD3
CD8
CD3
CD8




Cell number
OA CD3 CD4
OA CD3 CD4
OA CD3

CD4

OA CD3

CD8

CD3
CD4
CD3
CD4


CD3
CD8


CD3
CD8




CFSE
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)
19
Formation of germinal centers in early and
advanced RA bone marrow
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)
20
Czy komórki regulatorowe hamujace odpowiedz
immunologiczna sa w szpiku kostnym chorych na
RZS?
21
Plt0,05
Massalska et al. In preparation
22
Limfocyty T w szpiku kostnym chorych na RZS

• Aktywowane, limfocyty T CD4, CD8 sa obecne w
• Wykazuja wyzsza ekspresje recptorów dla IL-15
• Pod wplywem IL-15 proliferuja i wydzielaja IL-17
• Zwiekszone proporcje Th17 i IL-17
• Obnizone poziomy FoxP3, komórek regulatorowych
  Treg
• Tworzenie w szpiku kostnym typowych dla wezlów
  chlonnych centrów rozrodczych z aktywowanymi
  limfocytami T i B zarówno we wczesnym jak i
  zaawansowanym RZS

23
Funkcjonalne receptory Toll-podobne 9 (TLR9) sa
obecne w limfocytach B pochodzacych ze szpiku
pacjentów z RZS
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
24
Indukcja i podtrzymywanie odpowiedzi
immunologicznejdwa sygnaly, kostymulacja,
zagrozenie !!! PAMP, DAMP- PRR TLR,NLR,RLR,RAGE
(P. Matzinger 1994, 2004-2007)
bakteria
Kostymulacja (B7.1, B7.2, /CD28, CD40/CD40L...)
Sig.1
Sig.1
B
Th
PPR- pattern recognition receptors TLR- Toll-like
receptors NLR- NOD-like receptors RLR- RIG-I-like
receptors RAGE- receptor for advanced glycation
end-products
Help (sygnal 2) (IL-2, 4, 5....)
APC
bakteria
TLR
Cytokiny
PAMP
Sygnaly zagrozenia (Czasteczki DAMP)
Cialka apoptotyczne)
zdrowa
komórka
uszkodzona
PAMP pathogen associated molecular patterns
DAMP damage associated molecular
pattern
25
RA bone marrow-derived B-cellsexpress TLR9 at
mRNA and protein levels
Expression of mRNA encoding TLR9

bone marrow 1 2 3
4
peripheral blood
TLR9 (260 bp)
- RT
GAPDH (196 bp)
Expression of TLR9 protein
saponin
saponin
0,9
2,9
42,1
Isotype control
TLR9
TLR9
CD19
of CD19 cells expressing TLR9
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
26
CpG-ODN, but not GpC-ODN, enhance directly and
ina dose-dependent manner, the expression of
activation markers (CD86 and CD54) on bone marrow
B-cells
BMMCculture
Pure B-cellsculture
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
27
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
28
CpG-ODN stimulate proliferation of bone marrow
B-cellsin BMMC culture (increased Ki-67
expression and diminished CFSE content in CD19
cells)
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
29
CpG-ODN induce IL-6 and TNF-a secretionby bone
marrow B-cells

IL-6
TNF-a


p 0,02
p 0,02
IL-6 ( of untreated control)
ns
TNF-a ( of untreated control)
ns
Untreated Control
Agonistic control GpC-ODN
CpG-ODN
Untreated Control
Agonistic control GpC-ODN
CpG-ODN
60 hours of the cell culture
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
30
Bone marrow CD20 B-cells express TLR9
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
31
Bone marrow CD20 B-cells respond better to
CpG-ODN stimulation than their peripheral blood
counterparts
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
32
Higher frequency of bacterial DNA in bone marrow
samples from RA than OA patients
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
33
B-cell maturation in bone marrow
?
TLR 9
34
Podsumowanie i wnioski
(i) Limfocyty B pochodzace ze szpiku pacjentów z
RZS wykazuja ekspresje funkcjonalnych receptorów
TLR9, które uczestnicza w ich aktywacji,
produkcji TNF-a i IL-6, proliferacji i
róznicowaniu do komórek o fenotypie
CD19CD20CD27high in vitro (ii) IL-15
zwieksza indukowany agonistami TLR9 (CpG-ODN)
wzrost ekspresji CD86 i CD54, proliferacje i
promuje dalsze róznicowanie limfocytów B
CD19CD20CD27high w kierunku komórek
plazmatycznych (CD138CD19lowCD20low) (iii)
Podwyzszona czestotliwosc eubacteryjnego
16S-rybosomalnego RNA in próbkach szpiku od
pacjentów z RZS w porównaniu OA wskazuje na role
bakteryjnych infekcji w patogenezie RZS (iv)
Agonistyczne CpG-ODN poprzez TLR9 indukuja
ekspresje IL-15 i IL-15Ra w jednojadrowych
komórkach pochodzacych ze szpiku (BMMC) Te
dane wskazuja na udzial ligandów TLR9 i IL-15 w
aktywacji szpikowych limfocytów B i sugeruja
udzial w patogenezie RZS
35
Wnioski

• Szpik kostny jest wtórnym organem limfatycznym,
  który aktywnie uczestniczy w inicjacji i
  podtrzymywaniu chronicznego zapalenia w RZS
• Przyszle terapie RZS powinny brac pod uwage szpik
  kostny jako jedna z istotnych lokalizacji
  aktywowanych komórek

36
Podziekowania

• Zaklad Patofizjologii i Immunologii Klinika
  Reumoortopedii
• Tomasz Burakowski Pawel Maldyk
• Ewa Kontny Cezary Michalak
• Magdalena Chorazy-Massalska Leszek Jung
• Anna Radzikowska Jacek
  Kowalczewski
• Weronika Rudnicka
• Ewa Warnawin Zaklad Anatomii
  Patologicznej
• Maria Ziólkowska
• Monika Prochorec-Sobieszek