Microbiologia Clinica e Laboratorio

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Microbiologia Clinica e Laboratorio

• Docente Dott.ssa Mariateresa Vitiello
• Dipartimento di Medicina Sperimentale
• Sez. Microbiologia e Microbiologia Clinica
• Seconda Università degli Studi di Napoli
• Facoltà di Medicina e Chirurgia
• E-mail mteresa.vitiello_at_unina2.it
• Testi consigliati
• La Placa
• Poli

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Temi cardine del programma

• Lo sviluppo della microbiologia come scienza.
• Modalità di interazione tra microrganismi e
  ambiente.
• La natura e limportanza delle tecniche adottate
  per isolare, coltivare, osservare e identificare
  i microrganismi.
• Le principali tecniche batteriologiche e
  parassitologiche.
• I più frequenti batteri e parassiti agenti
  eziologici di malattie

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Programma desame

• Rapporti ospite-parassita saprofitismo,
  patogenicità, virulenza, opportunismo, fonti e
  serbatoi, veicoli e vettori di microrganismi,
  modalità di trasmissione e vie di ingresso,
  colonizzazione batterica, micetica, protozoaria e
  virale
• Flora microbica normalmente residente nei vari
  distretti corporei
• Principi di diagnostica microbiologica procedure
  di raccolta, conservazione, trasporto e
  trattamento dei campioni. Metodi di diagnosi
  diretta ed indiretta
• Diagnostica batterica esame microscopico,
  colturale, sierologico diretto, saggi di
  sensibilità agli antibiotici, reazioni Ag-Ab in
  vitro, tecniche di diagnostica molecolare per
  analizzare DNA ed RNA (PCR, ibridazione
  molecolare con sonde marcate, dot blot)
• I principali batteri responsabili di malattie
  Enterobatteri, Stafilococchi, Streptococchi,
  Brucelle, Pasteurelle, Treponemi, Micobatteri
• Diagnostica parassitologica tecniche colturali e
  substrati utilizzati in parassitologia
  (caratteristiche e differenze per scelta
  dimpiego), metodiche per identificazione da
  campioni biologici (esame diretto ed esame
  attraverso coltura), tecniche di preparazione
  vetrini, coloranti per la parassitologia,
  tecniche didentificazione metodologia classica
• I principali parassiti responsabili di malattie
  Toxoplasma, Plasmodi, Cestodi

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INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA

• Storia e scopo della Microbiologia

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Definizione

• La Microbiologia è la scienza che studia i
  microrganismi e la loro attività.
• Ha per oggetto la forma, la struttura, la
  riproduzione, la fisiologia, il metabolismo e
  lidentificazione dei microrganismi.

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Dimensioni dei batteri e dei virus
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(No Transcript)
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Dimensioni dei microrganismi
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Definizione

• Comprende lo studio della loro distribuzione in
  natura, delle relazioni tra loro e con gli altri
  esseri viventi, degli effetti benefici e dannosi
  che hanno sugli esseri umani, delle modificazioni
  fisiche e chimiche che provocano nel loro
  ambiente.

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Settori della Microbiologia

• BATTERIOLOGIA
• PROTOZOOLOGIA (Parassitologia)
• MICOLOGIA
• ALGOLOGIA
• VIROLOGIA

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Membri del mondo microbico

• Cellule procariotiche sono prive di un nucleo
  delimitato da una membrana (batteri)
• Cellule eucariotiche possiedono un nucleo
  racchiuso da una membrana, sono morfologicamente
  più complesse e generalmente più grandi delle
  cellule procariotiche (alghe, protozoi e miceti)

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Eukaryotic cell
Prokaryotic cell
Gram
(e.g. animal)
Flagellum
Nucleoid
Cell wall
Cell membrane
Rough endoplasmic reticulum
Nucleus
Gram -
Pili
Granule
Capsule
Cytoplasm
Cell (inner) membrane
Outer membrane
Mitochondria
Ribosomes
Cell wall
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Differenze tra cellula procariotica ed eucariotica
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Tipi di Classificazione

• Schema a cinque regni comprendente Monera,
  Protista, Fungi, Animalia e Plantae. I microbi si
  trovano nei primi tre regni
• Schema a tre regni, basato sul confronto dellRNA
  ribosomale. Classifica i microrganismi in
  Bacteria (batteri veri), Archaea e Eucarya
  (eucarioti)

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Regno degli Archaea tutti procarioti

• Procariotici
• Si distinguono dai Bacteria per sequenze
  ribosomali caratteristiche
• Non contengono peptidoglicano nella parete
• Molti si trovano in ambienti estremi
• Includono
• Metanogeni
• Alofili estremi
• Termofili estremi
• Non si conoscono specie patogene

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Regno Eucarya tutti eucarioti

• animali, piante e microrganismi eucarioti
• I microrganismi comprendono i protisti (alghe
  unicellulari, protozoi, muffe) e funghi
• La maggior parte sono più grandi delle cellule
  procariotiche

Parassiti animali pluricellulari
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Regno dei Bacteria tutti procarioti

• La maggior parte è costituita da singole cellule
• La maggior parte contiene peptidoglicano nella
  parete
• Possono sopravvivere in una infinità di ambienti
• La maggior parte non sono patogeni ed hanno un
  ruolo fondamentale nel riciclo dei nutrienti

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BATTERI
Sferica (cocchi) Cilindrica/bastoncellare
(bacilli) Curvata (vibrioni, spirilli)
Forma
CELLULA BATTERICA
STRUTTURE FUNZIONE
Involucro Capsula Parete cellulare Membrana citoplasmatica Aderenza, ostacola la fagocitosi Protezione, rapporto ospite parassita Scambi osmotici, secrezione, meccanismi energetici
Citoplasma Mesosomi Ribosomi Metabolismo generale Divisione cellulare,secrezione di esoenzimi,fosforilazione ossidativa Sintesi proteica
Sostanza nucleare (nucleo) genetica
Strutture accessorie Flagelli Ciglia Pili o fimbrie Spore (cellule dormienti) Mobilità Movimenti ondulatori Aderenza, trasferimenti genetici Sopravvivenza a condizioni avverse
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COMPONENTI STRUTTURALI DEI BATTERI
Membrana esterna
Granulo intracitoplasmatico
Citoplasma
Capsula
Spazio periplasmatico
Membrana citoplasmatica interna
Peptidoglicano
Flagello
Corpo basale
Ribosomi
Cromosoma
pilo
Mesosoma
pilo
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Criteri di classificazione
Spirilli
Forma cocchi (in colonie), diplococchi,
streptococchi, spirilli, vibrioni, bacilli
(isolati), spirochete.
Caratteristiche della parete cellulare
Gram-positivi o Gram-negativi
Gram Speciale colorazione inventata dall'omonimo
scienziato, che permette di dividere in due
grandi tronconi i batteri, i Gram e i Gram -,
in base alla composizione della parete batterica.
Cocchi e bacilli
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MORFOLOGIA BATTERICA
ESEMPI
STREPTOCOCCHI STAFILOCOCCHI
COCCHI
ENTEROBATTERI
BACILLI
TREPONEMA PALLIDUM VIBRIO CHOLERAE
SPIRILLI
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MORFOLOGIA BATTERICA
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MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI)
COCCHI SINGOLI
SARCINE
DIPLOCOCCHI
STREPTOCOCCHI
TETRADI
STAFILOCOCCHI
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MORFOLOGIA BATTERICA (BACILLI)
BACILLI
COCCOBACILLI
DIPLOBACILLI
STREPTOBACILLI
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Nomenclatura e classificazione dei microrganismi

• Linneo (Linnaeus) stabilì il metodo della
  nomenclatura binomiale nel sistema di
  classificazione delle piante e degli animali.
• A ciascun organismo sono attribuiti due nomi (in
  origine in latino) il primo si riferisce al
  GENERE di appartenenza dell'organismo stesso ed è
  uguale per tutte le specie che condividono alcuni
  caratteri principali il secondo termine, che è
  spesso descrittivo, designa la SPECIE
  propriamente detta.

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Nomi scientifici

• Staphylococcus aureus
• Descrive la distribuzione a grappolo dal greco
  stafule grappolo e coccos (bacca, acino
  d'uva) ed il colore dorato delle colonie.

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Nomi scientifici

• Escherichia coli
• Rende omaggio allo scienziato che lo ha scoperto,
  Theodor Eshcerich, e descrive lhabitat del
  batterio, il colon.

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Ruolo dei Microrganismi nelle malattie

• Non era poi così ovvio
• Stabilire una connessione dipendeva dallo
  sviluppo di tecniche per lo studio dei microbi
• Una volta stabilito, ha permesso lo studio delle
  difese dellospite - limmunologia

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Letà delloro della Microbiologia (1857-1914)

• Sono stati identificati molti organismi che
  producono malattie
• È stato intrapreso lo studio del metabolismo
  microbico
• Sono state raffinate le tecniche microbiologiche
• È stata migliorata la comprensione del ruolo
  dellimmunità e di come controllare e prevenire
  le infezioni microbiche

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Identificazione delle relazioni tra
Microrganismi e malattia

• Agostini Bassi (1773-1856)
• Ha mostrato che una malattia dei bachi da seta
  era causata da un fungo

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Altre evidenze

• Joseph Lister
• Fornisce evidenze indirette che i microrganismi
  sono agenti causali delle malattie
• Sviluppa una metodologia in chirurgia elaborata
  per impedire lingresso dei microrganismi nelle
  ferite ed una per il trattamento dei ferri
  chirurgici e per gli abiti da camera operatoria
• Poche volte i suoi pazienti andavano incontro a
  infezioni post-operative

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Prova finale

• Robert Koch (1843-1910)
• Stabilisce la relazione fra Bacillus anthracis e
  antrace
• Usa i criteri sviluppati dal suo maestro Jacob
  Henle (1809-1895)
• Questi criteri sono oggi noti come i postulati di
  Koch. Usati ancora oggi per stabilire il legame
  fra una particolare microrganismo ed una
  particolare malattia

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I postulati di Koch

1. Lagente causale deve essere presente in tutti i
   casi della malattia di cui è ritenuto
   responsabile e deve essere invece assente negli
   individui sani.
2. Lagente causale deve essere isolato
   dallindividuo affetto e, posto in coltura, deve
   dare origine ad una popolazione cellulare
   omogenea (una sola specie).

1. Linoculo di una coltura pura dellagente causale
   in individui sani deve dare luogo alla comparsa
   della malattia di cui si ritiene responsabile.
2. Lagente causale deve essere re-isolato
   dallindividuo infettato sperimentalmente.

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Lo sviluppo di tecniche per lo studio dei
microrganismi patogeni

• Il lavoro di Koch ha permesso la scoperta o lo
  sviluppo di
• agar
• piastre di petri
• nutrient broth e nutrient agar
• metodi per isolare i microrganismi

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Altri sviluppi

• Pasteur e Roux
• Hanno scoperto che la lunga incubazione di
  colture prima del trasferimento nellospite
  provocava nel patogeno la perdita della capacità
  di provocare la malattia
• Pasteur e collaboratori
• Hanno sviluppato il vaccino contro il colera dei
  polli, antrace e rabbia

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Altri sviluppi

• Emil von Behring (1854-1917) e Shibasaburo
  Kitasato (1852-1931)
• Hanno sviluppato unantitossina contro difterite
  e tetano
• Hanno fornito evidenze di unimmunità umorale
• Elie Metchnikoff (1845-1916)
• Ha scoperto le cellule fagocitarie del sangue
• Ha fornito evidenze di unimmunità cellulare

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Lo sviluppo della Microbiologia industriale e
dellEcologia microbica

• Louis Pasteur
• Ha dimostrato che sia la fermentazione alcolica
  che altre fermentazioni erano il risultato di
  attività microbica
• Ha sviluppato il processo di pastorizzazione per
  conservare il vino

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Nascita della moderna chemioterapia

• 1928 Alexander Fleming scoprì il primo
  antibiotico.
• Osservò che il fungo Penicillium produceva un
  antibiotico (la penicillina) in grado di uccidere
  lo Staphylococcus aureus.
• 1940s la penicillina fu clinicamente testata ed
  iniziò la produzione del farmaco

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Malattie Infettive

• Quando il patogeno supera la resistenza
  dellospite, si ha la malattia.
• Malattie infettive emergenti (EID) Nuove
  malattie e malattie a maggiore incidenza

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(No Transcript)
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Malattie Infettive Emergenti

• West Nile encefalite
• West Nile Virus
• Diagnosticata per la prima volta nella regione
  del West Nile dell Uganda nel lontano 1937.
• Nel 1999 è comparsa nella città di New York.

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Malattie Infettive Emergenti

• Ebola febbre emorragica
• Virus Ebola
• Causa febbre, emorragie e coagulazione del sangue
• Isolato per la prima volta nei pressi del fiume
  Ebola, Congo

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Malattie Infettive Emergenti

• Hantavirus sindrome polmonare
• Hantavirus
• Identificato per la prima volta nel 1951 in Korea
  come causa di febbre emorragica
• Nel 1995 è stata denunciata la comparsa di una
  nuova malattia caratterizzata da sintomi
  respiratori negli U.S.
• Il virus U.S., chiamato virus Hantavirus Sin
  Nombre, probabilmente è stato diffuso in U.S.
  tramite i ratti intorno al 1900

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Malattie Infettive Emergenti

• Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS)
• Human immunodeficiency virus (HIV)
• Isolato per la prima volta nel 1981.
• Epidemia mondiale infettante 40 milioni di
  persone 14000 nuove infezioni ogni giorno.
• Malattia a trasmissione sessuale che si trasmette
  sia agli uomini che alle donne.
• Negli U.S., le persone interessate dallHIV/AIDS
  hanno unetà compresa tra i 13 e 24 anni il 44
  sono donne ed il 63 sono uomini.

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Malattie Infettive Emergenti

• Encefalopatia Bovina Spongiforme
• Prioni
• Inoltre causa la malattia di Creutzfeldt-Jakob
  disease (CJD)
• La nuova variante di CJD negli uomini è correlata
  al consumo di frattaglie bovine contaminate.

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Malattie Infettive Emergenti

• Escherichia coli O57H7
• Ceppi produttori di tossine di E. coli
• Identificati nel 1982
• Principale causa di diarrea diffusa in tutto il
  mondo.

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Malattie Infettive Emergenti

• Streptococcus invasivo di gruppo A
• La rapida crescita batterica causa un esteso
  danno tissutale.
• Incremento dellincidenza dal 1995

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Malattie Infettive Emergenti

• Antrace
• Bacillus anthracis
• Nel 1877, Koch dimostrava che il B. anthracis era
  la causa eziologica dellantrace.
• Veterinari e agricoltori sono soggetti a rischio
  di antrace cutaneo.
• Nel 2001, la disseminazione di B. anthracis
  tramite posta infettava 22 persone.

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Limportanza dei microrganismi

• I microbi possono essere
• causa di malattie che colpiscono il regno
  vegetale ed animale
• causa di degradazione degli alimenti
• essenziali per la vita
• necessari per i cicli geochimici e la
  fertilizzazione del suolo
• utilizzati come biomassa e produttori di farmaci
  e molecole per uso industriale.

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Ruolo dei microrganismi in natura e loro
utilizzazione da parte delluomo

• Vengono utilizzati come modelli sperimentali per
  lo studio della genetica molecolare e della
  fisiologia cellulare.
• Vengono utilizzati per la produzione di sostanze
  utili alluomo

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• Alcuni impiegati come fonti per
• produzione commerciale di antibiotici, farmaci e
  altre sostanze (vari aminoacidi ed enzimi)

• produzione di acido acetico e aceto

• fermentazione lattica del lattosio per la
  produzione di formaggi e yogurt

• acido lattico usato anche per conservazione di
  crauti e nelle salamoie acide

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Biotecnologie Moderne ed Ingegneria Genetica

• Biotecnologia, luso di microbi per produrre cibi
  e sostanze chimiche (sfruttamento dei microbi sin
  dallantichità).
• Lingegneria genetica è una tecnica nuova nelle
  biotecnologie. Attraverso lingegneria genetica ,
  i batteri ed i funghi possono produrre una
  varietà di proteine tra cui i vaccini ed enzimi.
• Nelle cellule umane i geni mancanti o difettivi
  possono essere sostituiti nella terapia genica.
• Batteri geneticamente modificati vengono
  utilizzati per proteggere i raccolti dagli
  insetti e dal congelamento.

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Insetticidi Biologici

• Microbi patogeni per gli insetti sono
  lalternativa ai pesticidi chimici in agricoltura
  e nella trasmissione di infezioni.
• Le infezioni da Bacillus thuringiensis sono
  letali per alcuni insetti, ma innocue per altri
  animali, come luomo, e per le piante.

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Bioriparatori

• I batteri degradano la materia organica dei
  liquami.
• I batteri degradano o detossificano inquinanti
  come gli olii ed il mercurio

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Studio dei batteri di interesse medico
Le nozioni che il biotecnologo dovrebbe possedere
per ogni batterio patogeno sono quelle necessarie
a configurarne un modello mentale, completo dei
caratteri sufficienti a definirne le
caratteristiche morfo-funzionali utili a
comprendere il meccanismo dellazione patogena, e
da utilizzare come base per la comprensione delle
tecniche di identificazione a scopo diagnostico
impiegate più correntemente nel laboratorio
batteriologico.
OFFRIRE AL PAZIENTE LA PRESTAZIONE MIGLIORE
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Inquadrare i diversi batteri in un contesto
generale, elaborato su pochi dati precisi, dando
per scontate le ampie zone di uniformità morfo-fun
zionale che accomunano larghi gruppi di batteri
Focalizzare lattenzione sulle peculiarità
che caratterizzano i singoli batteri
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Elaborazione del modello del batterio X

• Non è necessario imparare a memoria se esso è
• sporigeno o asporigeno
• mobile o immobile
• se produce esotossine o endotossine
• se è aerobio o anaerobio
• etc

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Esempio Il batterio in questione è un cocco
Lo dice il nome stafilococco, streptococco, etc.
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Altro esempio aerobio o anaerobio?
Tutti i batteri di interesse medico sono
aerobi-anaerobi facoltativi
Eccezioni - Brucelle aerobi obbligati -
Clostridi anaerobi obbligati
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Altro esempio sporigeno o asporigeno?
La maggior parte dei batteri di interesse medico
sono asporigeni

• Eccezioni
• Bacillus spp
• - Clostridi

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Per sapere in quali terreni cresce un batterio è
sufficiente ricordare i batteri che necessitano
di terreni arricchiti di particolari sostanze (ad
esempio gli emofili) o di incubazione in
condizioni particolari (batteri anaerobi e o
microaerofili) e, quei batteri che non ancora
sono stati coltivati in terreni abiotici per
ragioni sconosciute (Treponemi) o perché
parassiti intracellulari obbligati (Rickettsie,
Clamidie)
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Apprendimento dei caratteri differenziali
Indiscriminata memorizzazione dei numerosi
caratteri comuni
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• SCHEMA DI STUDIO PER LA BATTERIOLOGIA
• Struttura e caratteri antigenici
• Fattori di virulenza
• Patogenesi e immunità (meccanismi dellazione
  patogena e risposte dellospite)
• Malattia (sindromi cliniche e fattori
  predisponenti)
• Diagnostica di laboratorio (microbiologica e
  sierologica)
• Cenni di terapia e profilassi (terapia di
  elezione e vaccinazione)