Premesse e riepilogo

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Premesse e riepilogo
Lezione 1
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Scopo del corso
Lo scopo di questo corso non e quello di
imparare la clinica delle malattie, ma capire
come si sceglie un test diagnostico nei casi di
malattie che coinvolgono il materiale ereditario.
Quindi dovrete rinfrescarvi la Genetica fatta
finora. In questo corso parleremo di diagnostica
e quindi necessariamente dovremo parlare di
malattie, ma ora come sempre le malattie ci
servono come modelli per capire le strategie.
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Cosa significa ricerca delle mutazioni.
Vi ricordo che mutazione significa semplicemente
variazione di una sequenza confrontata con una
sequenza di riferimento. Da questo ne consegue
che mutazione non vuol dire che ci sia un effetto
patologico. Vi ricordo la definizione di
polimorfismovariazione presente nella
popolazione con una frequenza superiore a 1.
Per definizione un polimorfismo e innocuo,
almeno finche non si dimostra il contrario. E
comunque vero che generalmente quando si parla di
mutazione si intende una variazione patogenetica
e il polimorfimo viene chiamato anche variante
allelica, tuttavia non e completamente corretto
e noi specificheremo sempre mutazione
patogenetica o non patogenetica
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Mutazioni
Il genoma umano, come tutti i genomi e plastico
la sopravvivenza di una specie dipende dalla sua
variabilita e dalla capacita di evolvere. Il
genoma umano e il risultato di eventi di
poliploidizzazione che hanno modificato
drasticamente il numero cromosomico. Le mutazioni
cromosomiche di solito alterano il fenotipo
riducendo la fitness, e sono pertanto rare a
livello costituzionale, ma frequenti a livello
somatico nei tumori. A livello molecolare si
distinguono diversi tipi di mutazione che ormai
dovreste conoscere percio vi risparmio il loro
elenco. La variazione di una sequenza in una
popolazione naturale non comporta necessariamente
linsorgenza di un fenotipo anomalo. Quando si
parla di alleli di un locus questi sono il
risultato di una mutazione che per caso, per
effetto della deriva genetica si sono fissati
nella popolazione

• Eterozigosi media per il DNA genomico umano
  0,0037 (0,37). Cio significa che in due alleli
  circa 1250-11000 basi sono diverse

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Mutazioni

• Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso
  percio sia il DNA codificante che il non
  codificante sono egualmente suscettibili. Le
  conseguenze sono ovviamente diverse. Le
  conseguenze nella parte codificante (che
  costituisce circa il 3 del genoma umano) sono
  legate al tipo di mutazione e anche questo lo
  sapete.

Le mutazioni del DNA non codificante hanno
effetto se avvengono nelle sequenze regolatrici o
nelle sequenze introniche deputate allo splicing.
Anche in questo caso leffetto dipende dal
mantenimento della funzione.
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Mutazioni

• Sostituzione silente non determina alcun
  cambiamento nel prodotto
• lamminoacido resta lo stesso. Dal momento che
  modifica la sequenza puo
• originare un RFLP. In qualche caso puo dare
  origine ad un sito di splicing
• criptico e quindi essere tuttaltro che neutre
  come la semplice sequenza
• potrebbe far pensare.

• Sostituzione non senso si origina un codone di
  stop. Dal momento che la
• pressione selettiva e forte su un prodotto
  troncato prematuramente, sono
• rare.

• Sostituzione di senso erratosi origina un codone
  per un altro amminoacido

• conservativa il nuovo amminoacido ha
  caratteristiche chimiche simili al vecchio.
• Pertanto leffetto sul prodotto puo essere
  minimo e puo essere definito polimorfismo
• sia a livello di DNA che di prodotto.

• non conservativa il nuovo ammnoacido e
  completamente diverso dal vecchio. Puo avere
  effetti deleteri.

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Mutazioni
Il tasso e il tipo di sostituzioni percio e
estremamente variabile fra i diversi geni.
Alcune proteine come le ubiquitine hanno un
livello di conservazione totale nella scala
zoologica dalluomo al lievito. La loro sequenza
a livello di DNA indica che le sostituzioni ci
sono, ma sono praticamente tutte sinonime.
Allestremo opposto ci sono geni pochissimo
conservati se non in brevi domini nellevoluzione
come SRY. SRY ha una funzione chiave in tuttii
mammiferi, ma questa e demandata all HMG box,
che corrisponde a 78 aa. I segmenti N- e C-
terminali sono estremamente variabili, indicando
che per la funzione del gene questi segmenti non
sono critici
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Mutazioni dinamiche
Mutazioni dovute allespansione di trinucleotidi
localizzati nelle regioni codificanti o
non-codificanti di alcuni geni, si originano per
errori nella replica del DNA.

• Non tutte le espansioni sono instabili. Se
  laumento di lunghezza non e eccessivo, e una
  mutazione patogena ma stabile nella trasmissione.
  Si comportano cioe come le mutazioni
  canoniche, e seguono le leggi di Mendel

Gene HOXD13 lespansione determina la
formazione di lunghi tratti di polialananina, e
provoca sinpolidattilia. E rimasta stabile per 7
generazioni

• Quando una sequenza trinucleotidica cambia le
  proprie dimensioni da una generazione allaltra
  si parla di mutazioni dinamiche

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Mutazioni che alterano i meccanismi epigenetici
Imprinting
Principio dellequivalenza dei gameti
lespressione di un gene non dipende dal sesso
del genitore che lo trasmette.
Esclusione allelica in alcuni tipi cellulari
viene espresso uno solo dei due alleli, anche se
entrambi sono in grado di esprimersi. Si ha una
emizigosi funzionalelinfociti B e
immunoglobuline, geni dei recettori olfattivi nei
neuroni ....
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Ricordiamo cosa non e e cosa e limprinting

• Leredita mitocondriale non segue il principio
  dellequivalenza dei gameti, ma in questo caso
  non si parla di imprinting i gameti sono
  effettivamente non equivalenti in termini di
  contenuto genico perche il gamete maschile non
  contribuisce alla dotazione di mitocondri
  dellembrione.

• Leredita legata al sesso non segue il
  principio dellequivalenza dei gameti, ma di
  nuovo i gameti sono effettivamente non
  equivalenti perche i cromosomi sessuali non sono
  del tutto omologhi. Lespressione di un fenotipo
  dovuto a un locus localizzato sui cromosomi
  sessuali dipende dal sesso della progenie.

Imprinting genomico espressione differenziata di
un gene perfettamente funzionale legata
allorigine parentale, indipendente dal sesso
della progenie, che puo essere limitata nello
spazio e nel tempo.
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Mutazioni cromosomiche
Sono una categoria di mutazioni rara nel
costituzionale, e il piu delle volte sono
patogenetiche. Possono provocare patologie gravi
a livello dellindividuo e quindi non vengono
ereditate. Oppure ridurre la fitness per la
presenza di gameti sbilanciati, ma possono venir
trasmesse alla generazione successiva per la loro
tollerabilita in eterozigosi. Sono frequenti nei
tumori, dove possono indurre la tumorigenesi a
causa della creazione di geni ibridi, o perche
portono alla sovraespressione di geni
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Modifiche nella configurazione della cromatina
Il cambiamento di configurazione, legato ad un
effetto di posizione per un riarrangiamento, puo
portare alla manifestazione di fenotipi
patologici Aniridia silenziamento del
gene PAX6 Distrofia Facioscapolomerale
una delezione di 3-4Kb elimina dalla regione
compresa fra due geni FRG1 e FRG2, delle
sequenze ripetute denominate D4Z4. La perdita di
queste sequenze porta questi due geni normalmente
localizzati in due domini diversi, a mappare
nello stesso dominio. Lassenza delle ripetizioni
che interagiscono con proteine regolatrici per
modificare lespressione di questi geni,
comporterebbe un over espressione, con
conseguente fenotipo patologico
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RIEPILOGO TECNICHE
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SNP

• SNPs nella regione codificante di un gene,
  alterando la struttura di una
• proteina, possono essere la causa di disordini
  monogenici ereditati in maniera dominante

sono routinariamente usati a scopo diagnostico

• SNPs che alterano la struttura primaria di una
  proteina coinvolta nel
  metabolismo di un farmaco

bersagli dellanalisi farmacogenetica

• SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma,
  quindi senza impatto sul fenotipo dellindividuo

markers usati in genetica di popolazione e negli
studi di evoluzione
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ASO (Allele Specific Oligonucleotide)
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SSCP Single Strand Conformational Polymorphism
A
C
C
G
G
T
A
A
C
G
T
T
A
C
C
G
T
G
A
A
C
T
G
T
G
T
A
C
Omo WT
Omo mut
etero
VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA
DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL
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DGGE elettroforesi su gel in gradiente denaturante
Si amplifica il DNA con primer alla cui estremita
5 a monte e stata aggiunta una coda di G.
questa coda generera un allungamento della
sequenza amplificata con una serie di CG (40basi)
che tenderanno a stabilizzare la molecola e
aumentano la capacita discriminante della corsa
elettroforetica.
Si basa sulla selettivita del gel che deve
essere in grado di creare un gradiente di
denaturazione molto stringente LINIZIO della
denaturazione con formamide o urea dipende dalla
sequenza la variazione anche di una singola base
puo modificare la risposta allagente
denaturante per cui una sequenza comincia a
denaturarsi prima o dopo quella di riferimento.
il limite della tecnica e la messa a punto delle
condizioni sperimentali che richiedono una
accurata conoscenza della sequenza da testare.
La presenza della sequenza di riferimento in
banca dati facilita la messa a punto con questa
tecnica e possibile individuare il 99 delle
variazioni
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DGGE elettroforesi su gel in gradiente denaturante
PCR
GGGG
CCCC
Gel denaturante
Denaturazione crescente
Fig 7.7
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DGGE schema II
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DGGE gel
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DGGE CFTR
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DGGE esone 12 CFTR
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DGGE ?-Thalassemia
Figure 1 shows ß-thalassemia samples run on a
parallel DGGE gel. The three heterozygous samples
in lanes 13 were resolved into two heteroduplex
and two homoduplex bands. The heteroduplex bands
(upper bands) migrated slower than the
corresponding homoduplex bands (lower bands). The
wild-type sample in lane 4 was resolved as one
band, and it migrated to the same distance as the
wild-type band in the mutant samples. The ability
to resolve the heteroduplex fragments and the
mutant homoduplex fragment in the mutant samples
makes it possible to distinguish between samples
that are mutant or wild type. From the results,
it was possible to detect single base
substitutions in the mutant samples from the
wild-type sample using parallel DGGE.
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DGGE Poliposi del colon
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MLPAMultiplex Ligation Probe Amplification
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MLPAMultiplex Ligation Probe Amplification
Each peak is the amplification product of a
specific probe. Samples are compared to a
control sample. A difference in relative peak
height or peak area indicates a copy number
change of the probe target sequence
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MLPAMultiplex Ligation Probe Amplification
Mismatch
Perfect match
Ligation of the two probe oligonucleotides ?
Amplification product
Mismatch at the probe ligation site ? No
ligation, no amplification product
Normal
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MS-MLPA
Only undigested (methylated) and ligated probes
are exponentially amplified
29
MS-MLPA
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Il materiale didattico e presente in rete
http//www.biologia.uniba.it/DIGEMI/Didattica.ht
mlsono presenti anche i file PDF degli articoli
necessariper la preparazione