Observations macroscopiques

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Observations macroscopiques
Coupe dembryon de souris
Feuille entière
Marquages - enzymes (peroxydase,
phosphatase alcaline) - or
colloïdal - fluorescence (FITC, Alexa
488, Cy2 )
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Observations microscopiques

• Microscopes optiques
• Ordinaire (fond clair)
• Microscopes à fluorescence - classique
  - confocal / balayage laser
• - classique
• - 2/multi-photons
• - spectroscope à corrélation
• de fluorescence
• Microscopes électroniques
• - à transmission
• - à balayage
• Microscope à force atomique

First "touching" microscope, 1995
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Microscope à fluorescence
Appareil photonumérique
Oculaire
Epi- illumination

• Cube
• avec
• filtre darrêt
• miroir dichroïque
• filtre dexcitation

Boîtier avec lampe à arc HBO ou xénon
Préparation
Condenseur
Trans- illumination
(Photos des cubes documentation Nikon)
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Microscope confocal / à balayage laser
Détecteur (photomultiplicateur)
Sources de lumière

• (Lampe vapeur Hg)
• Lasers
• - Argon 455, 488, 515 nm - He-Ne
  545 nm
• - He-Ne 633 nm

Diaphragme du détecteur (pinhole)
Miroir dichroïque
Source de lumière ponctuelle (laser)
Lentille objectif
Plan focal
Echantillon
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Exemple de microscope confocal LSM 510 de Zeiss
Microscope inversé
Acquisition dimages
Lasers
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Le système Zeiss "META"

• Fournit une signature spectrale pour chaque pixel
  de l'image gt séparation des composés
  fluorescents
• Applications
• détection/identification des composés
  autofluorescents
• détection du "crosstalk" lors de marquages
  multiples
• séparation (et utilisation possible) de traceurs
  à spectres d'émission proches
• suivi, dans la cellule vivante en fonction du
  temps, de modifications du spectre d'émission de
  traceurs FRET (Fluorescence Resonance
  Energy Transfer) association du traceur à une
  autre molécule fluorescente.
• suivi de phénomènes vitaux, au moyen
  d'indicateurs fluorescents dont les spectres
  d'excitation/émission
• varient en fonctions de paramètres tels que
  pH, concentrations ioniques, etc.

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Avantages du microscope confocal

• Résolution améliorée - microscope
  conventionnel R ? 0,61 ? / ON - microscope
  confocal R ? 0,46 ? / ON Exemples
• x 20 huile x 40 huile x 60 huile
• ON 0,75 N 1,3 ON 1,4
• Conventionnel 0,40 µm 0,30 µm 0,20 µm
• Confocal 0,30 µm 0,17 µm 0,16 µm
• Traitements - analyses dimages
• - Reconstructions 3D à partir de sections
  optiques

Etc.
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Fluorescence 2 (multi) - photons
Noyau
e-
e-
Emission de fluorescence
1 photon
2 photons 10 -15 s
Laser continu de faible puissance
Laser pulsé (100 femtosecondes à 80 MHz) de forte
puissance à longueur donde fixe ou réglable
entre 700 et 1200 nm
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Avantages du microscope confocal multi-photons

• Les radiations (700-1200) dégradent peu les
  échantillons vivants
• Possibilité dexciter de molécules fluorescentes
  émettant dans courtes longueurs donde (UV -
  bleu)
• Pas de fading en dehors du plan focal

Confocal classique
Multi-photons Le fluorochrome nest excité quau
point de focalisation

• Le pinhole nest plus nécessaire

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Avantages du microscope confocal multi-photons

• les radiations pénètrent profondément à
  lintérieur des échantillons

Auteur du cliché ?
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Microscopie en lumière structuréeZeiss
"ApoTome", Optigrid,
Sans Apotome
Avec Apotome
Souris injectée avec des immunoglobulines
humaines Marquages sur coupes au cryostat -
anti-B220-phycoérythrineRouge (rouge)
lymphocytes B - anti-IgG humaines-FITC (vert)

• Intérêt
• Beaucoup moins cher qu'un système confocal
• Aussi simple d'emploi qu'un microscope à
  fluorescence classique
• Images quasi-instantanées
• Utilise une source de lumière classique (par
  exemple une lampe HBO) pas de limitation dans
  le choix des fluorochromes.

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TIRF - TIRFMTotal Internal Reflection
Fluorescence MicroscopyIllumination par onde
évanescente
Éléments immunomarqués
Échantillon
Lamelle
n2
Onde évanescente
n1
Rayons lumineux
Objectif TIRF
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Traitement dimages la déconvolution
Déconvolution
Point Spread Function
Microscope à fluorescence classique
Déconvolution
Confocal déconvolution
Confocal
D
Auteur du cliché ?
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Les microscopes électroniques

• Deux types
• Transmission permet d'observer des coupes
  ultra-fines
• Balayage permet d'observer la surface
  d'objets
• Ils permettent d'obtenir des grossissements et
  des résolutions considérablement plus élevés
  qu'en microscopie optique
• MO ME (transmission)
• Grossissement x 1000 x 1 000 000
• Résolution 200 nm 3 Å (0,3 nm)

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Microscope électronique en transmission
Canon à électron
Condenseur(s)
Porte objet
Objectif
Lentilles de projection
Ecran fluorescent
Système photographique
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Microscope électronique à balayage
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Microscope à force atomique (AFM)
Photodiodes
Laser
Reconstruction dimage par ordinateur
Levier
Anticorps
Mirroir
Antigène
Pointe
Echantillon
Y
Déplacement de léchantillon
X
Exemple dAFM Matériel Molecular
Imaginghttp//www.molec.com/
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Cytométrie en flux (FACS) et tri cellulaire
Exemple de FACS Becton-Dickinson FACScan