Projets de th

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Projets de thérapie cellulaire et génique 
études précliniques et conduite de lessai
clinique

• Fabian GROSS
• Chef de projet Biothérapies
• CIC BT/DRI CHU de Toulouse

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Développement dun médicament
Laboratoire de recherche et promoteur Approches
in vitro et in vivo relevant de la pathologie
visée par le protocole clinique. Développement
du  médicament expérimental 

• Laboratoire de recherche
• Intérêt dune cible ou dune approche
  expérimentale (in vitro et in vivo)

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Etudes Pré Cliniques le contexte
Déterminent la valeur thérapeutique et les
investigations chez lhomme (paramètres cliniques
à surveiller)

• Etudes Pharmacologiques activité du produit
• Etudes Pharmacocinétiques devenir et
  intéractions du médicament dans lorganisme
  (homme ou animal)
• Etudes Toxicologiques effets adverses dun
  produit
• Toxicité aigüe
• Toxicologie chronique
• Toxicologie de la fonction de reproduction
• Etudes de mutagénèse
• Etudes de cancérogénèse

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Etudes Pré cliniques Stratégie Adoptée

• Préambule - Produit ou Médicament identique
  ou comparable a celui de lessai clinique
• Méthodes et techniques validées (in vitro et in
  vivo)

• Principales lignes directives International
  Conference of Harmonization
• Nature des études selon le stade de développement
  du produit ICH M3 (CPMP/ICH/286/95)
• Produits biotechnologiques ICH S6
  (CPMP/ICH/302/95)
• Application Thérapie anticancéreuse ICH S9
  (CPMP/SWP/997/96)

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Dossier de Pharmacologie
Etudes pharmacocinétiques Données sur
labsorption, le métabolisme, la distribution, la
fixation des protéines plasmatiques, lexcrétion
et le bilan de radioactivité Si étude in vitro
gt matériel dorigine humaine
Etudes pharmacologiques Pharmacodynamie Données
in vivo et in vitro de lactivité du produit liée
ou non a leffet thérapeutique attendu Pharmacolo
gie de sécurité Effets sur système respiratoire,
nerveux et cardiovasculaire gt voir études de
toxicologie
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La toxicologie conditionne la première dose à
administrer à lhomme
Seuil de tolérance Aucun effet pharmacologique
(NOEL No Effect Level) Secondaire (NOAEL No
Adverse Effect Level)
Seuil defficacité MABEL (Minimal Anticipated
Biological Effect Level )
Dose Maximale Tolérée MTD
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Toxicologie Générale
Etudes BPL (directives 2004/10/CE et guidelines
applicables EMEA Guideline EMEA/CHMP/410869/2006
du 31/07/2007)

• Objectifs
• Détermination de la 1ère dose injectée à lhomme
  (Phase 1)
• Identification des effets adverses et dorganes
  cibles (NOEL et NOAEL)
• Reversibilité des effets adverses
• Relation effets du produit et de ses métabolites
• Influence du sexe, de la dose, du temps
  dexposition ou dautres facteurs
• Design
• Groupes Control (véhicule seul), faible dose
  (NOEL), forte dose (MTD) et dose moyenne
• Animaux 2 espèces (un non rongeur), ? et ?
• Durée 24h à 2 ans
• Voie et régime administration IV et voie
  clinique envisagée

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Etude de Biodistribution et de Toxicité par
administration unique

• Injection
• IV puis voie clinique, suivi pendant 2 à 5
  semaines
• Escalade de doses selon un processus séquentiel
• Suivi
• Observations cliniques sur les 1ères 24h puis 1 à
  2 fois par semaine
• Analyses biologiques et biochimiques
• Sacrifice et Autopsie
• Examens anatomo-pathologiques dune 12aine
  dorganes
• Etude du potentiel immunotoxique
• Dosage du médicament expérimental ou des cellules
  dans les organes

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Exemple du CYL-02
Injection IV du CYL-02 (1er lot pré-GMP) chez la
souris de 250µg/kg à 7500µg/kg Suivi
Observations cliniques et analyses bio et bioch
(sang, urine) Autopsie Examens
anatomo-pathologiques de 12 organes
tumeur Dosage du transgène (organes, sang et
urines)
Définition de la NOAEL à 1500µg/kg
10
Quantification des transgènes par qPCR
Répartition de la positivité sexe/organes/doses
confondus Biodistribution Poumon, foie, rein,
muscle et gonades
Pic de détection à 6h post injection
11
Toxicité et biodistribution par voie  clinique 

• Conduit sur un 2ème modèle animal
• OBJECTIFS
• Calculer la première dose à administrer à lhomme
  suivant le mode dadministration prévu en
  clinique
• METHODES
• Modèle animal pathologie ou du modèle détude si
  non disponible
• Injection du ME par la voie clinique, suivi des
  animaux sur les jours suivant et 1 à 2 fois par
  semaines (biologie et biochimie).
• Traitement de lanimal par les traitements
  concomitants de létude
• Entre 2 et 5 semaines, sacrifice des animaux et
  prélèvement des organes pour anapath et dosage du
  médicament expérimental

12
Toxicité intratumorale du CYL-02
4 groupes Glucosé 5 (véhicule) avec ou sans
traitement Gemcitabine CYL-02 (900µg/kg) avec ou
sans traitement Gemcitabine
J9, 11 et 13 Injections intrapéritonéales de
Gemcitabine (80 mg/kg).
J15 Sacrifice des animaux et prélèvement des
organes.
J0  queue du pancréas par mini-laparotomie
gauche (allogreffe orthotopique)
J7 Contrôle de lévolution de la tumeur par
laparotomie médiane exploratrice. Injection et
suivi des animaux.
Aucune létalité dans lensemble des groupes ayant
reçu le CYL-02 seul ou associé à la gemcitabine.
13
Résultats de la biodistribution après injection
intra tumorale
CYL-02 NaCl CYL-02 Gemcitabine
Tumeur
Rate /-
Foie
Rein et intestins - /-
Poumons, muscles et gonades - -

• Biodistribution 
• Présence du transgène dans la tumeur 8 jours
  après une injection intra-tumorale.
•  CYL-02 gemcitabine , faible positivité au
  niveau rénale et intestinal alors que positif au
  niveau splénique
• Suivi pondéral
• Aucune anomalie pondérale et clinique dans le
  groupe CYL-02,
• Amaigrissement significatif (15 en moyenne) avec
  la gemcitabine,
• Aucune différence significative entre
   gemcitabine seule  versus   CYL-02
  gemcitabine.
• Examen anatomopathologique macroscopique 
• Aucune lésion pancréatique, péritonéale, ou
  hépatique

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Etude de Toxicité à dose répétée du Cyl-02
OBJECTIFS Simulation du protocole proposé chez
lhomme Accumulation Sensibilisation Cerner la
Pharmacologie de Sécurité Calculer la première
dose à administrer à lhomme
Calcul de la 1ère dose injectable à lhomme HED
(Dose équivalente chez lHomme) NOAEL (Animal)/
Facteur de sécurité/ fact clearance
(Homme/Animal) Soit 900µg/Kg/60/7,4
2µg/kg Poids moyen dun patient ACP de 63kg gt
125µg
15
Exemple détude de biodistribution

• Injection de 2.106 CSM dans lorgane considéré
  sur le modèle animal Nude de la pathologie visée
  par létude clinique sur des 10x? et 10x?
  vehicule seul (CTRL ) et CSM
• Surveillance des signes cliniques des animaux
  (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine
• Sacrifice à 3 semaines (toxicité aigüe) et 12
  semaines (toxicité chronique), observation
  macroscopique sur 8 organes (ganglions, foie,
  cerveau, reins, rate, peau, gonades et poumons)
  organe injecté
• Résultat Evolution du poids, morbidité,
  mortalité et signes de toxicité,
  anatomopathologie
• Recherche de cellules humaines par qPCR (ALU)

Aucune altération des organes Aucune cellule
humaine à 3 et 12 semaines
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Génotoxicité

• OBJECTIFS
• Recherche de toute modification du matériel
  génétique induite par le ME
• Recherche dune potentialité mutagène
• MODALITE
• Etudes normalisées in vitro et in vivo,
  comprenant
• Test de mutation génique in vitro sur bactéries
  (test de Ames)
• Test daberrations chromosomiques in vitro sur
  cellules de mammifères
• Optionnel Test daberration chromosomique in
  vivo sur cellules hématopoïétiques de rongeur
  (test du micro noyau)

Thérapie Génique Mutagénèse insertionnelle des
vecteurs viraux Thérapie Cellulaire
Tumorigénicité des cultures cellulaires
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Exemple détude de tumorogénicité

• Injection intramusculaire ou sous cutanée chez la
  souris Nude (5 animaux/grpe) de 10.106 CSM
  HT29 (CTRL) véhicule seul (CTRL ) et CSM
• Surveillance des signes cliniques des animaux
  (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine
• Mesure des nodules 1 a 2 fois par semaine pendant
  12 semaines
• Sacrifice à 90 J et observation macroscopique sur
  le site dinjection et 6 organes (en général
  ganglions, foie, cerveau, reins, rate et poumons)
• Si apparition de tumeurs, qPCR pour recherche de
  cellules humaines (ALU)
• Résultats Suivi des animaux, poids,
  anatomopathologie et volume des tumeurs

Résorption au point dinjection en 3 à 6 jours
Pas de développement de tumeur Aucune altération
des organes à 90J
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Développement dun médicament
Laboratoire de recherche et promoteur Approches
in vitro et in vivo relevant de la pathologie
visée par le protocole clinique. Développement
du  médicament expérimental 

• Laboratoire de recherche
• Intérêt dune cible ou dune approche
  expérimentale (in vitro et in vivo)

Promoteur Protocole clinique sur des volontaires
(sains ou patients) suivant des modalités
dinclusion et de suivi prédéfinies
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Documents spécifiques à la TG
Documents spécifiques à la thérapie génique
Ces documents sont a fournir par le promoteur
lors de la demande dAutorisation dEssais
Clinique (AEC) faite à lANSM et au HCB en plus
des documents communs.  CERFA n 1253602
agrément des locaux de recherche clinique en
fonction du classement de lOGM établit par le
HCB. Décret n93-773 du 27 mars 1993 et arrêté du
27 décembre 1994.  Annexe 2 Principes
applicables a lévaluation du risque pour
lenvironnement décrit en termes généraux
l'objectif à atteindre, les éléments à prendre en
considération et les principes généraux ainsi que
la méthodologie à suivre pour effectuer
l'évaluation des risques pour l'environnement.
Directive 2001/18/CE du 12 mars 2001.  Annexe 3A
Informations devant figurer dans la
notification concernant la dissémination des OGM
autres que les plantes supérieurs. Directive
2001/18/CE du 12 mars 2001.  Formulaire de
synthèse de la notification concernant la
dissémination volontaire dOGM dans
lenvironnement à dautres fins que leur mise sur
la marché. Directive 2001/18/CE du 12 mars
2001.  Fiche dinformation destinée au Public
présente les buts et les utilisations prévues de
la dissémination, la description synthétique et
les méthodes de surveillance. Cette fiche
d'information permet de procéder à une
consultation du public sur cette dissémination et
doit donc préciser les modalités de cette
consultation et la date limite de réponse de 30
jours après sa publication sur le site internet
de lANSM. Directive 2001/18/CE du 12 mars
2001. Remarque la fiche dinformation destinée
au Public est différente de la notice
dinformation aux patients et ne la remplace en
aucun cas.  

• Demande de classement initial et dagrément CERFA
  167402
• Intégrer dans la demande lutilisation pour essai
  clinique (addendum demande initiale)
• Demande dagrément des sites hospitaliers CERFA
  1253602
• Confinement doit être en adéquation avec le
  classement de lOGM.
• Une demande dagrément dutilisation confinée
  dOGM par site (pharmacie, chambre hospitalière,
  laboratoire, local dadministration).
• numéro de dossier identique à celui du classement
  établit initialement par le HCB.

• Annexe 2 Principes applicables a lévaluation
  du risque pour lenvironnement.
• Annexe 3A Informations devant figurer dans la
  notification concernant la dissémination des OGM
  autres que les plantes supérieurs.
• Formulaire de synthèse de la notification
  concernant la dissémination volontaire dOGM dans
  lenvironnement à dautres fins que leur mise sur
  la marché.
• Fiche dinformation destinée au Public date
  limite de réponse de 30 jours après sa
  publication sur le site internet de lANSM

20
Circuit du médicament

• Sérologies patient (HIV 12, HTLV 12, HBC et
  HCV, Syphilis)
• Autorisation du lieu de prélèvement (bloc
  opératoire, anesthésie et praticien)
• Cahier navette

Prélèvement de TA
Ponction de MO
Autorisation de site
21
Circuit du médicament
Congélation ou Mise en culture
Prélèvement de TA
Ponction de MO

• Transport avec respect des T (ambiant, froid ou
  congelé) et des délais
• Règlementation transport matières vivantes
  (directive européenne 2004/23/CE)

Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
22
Circuit du médicament
Autorisation de production
Congélation ou Mise en culture
Expansion cellulaire ou transfert de gène
Prélèvement de TA
Ponction de MO
Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
Cellules SA
Libération, congélation de la SA

• Etablissement autorisé (établissement
  pharmaceutique ou non, classement pour OGM)
• Contrôles in process (stérilité)
• Délivrance dun certificat de conformité

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Circuit du médicament
Autorisation de production
Congélation ou Mise en culture
Expansion cellulaire ou transfert de gène
Prélèvement de TA
Ponction de MO
Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
Cellules SA

• Préparation pharmaceutique, stockage,
  décongélation, mise en forme, dispensation /-
  confinement (double ou triple emballage)
• Retour et destruction des UT, pb de
  linactivation des OGM
• solides a autoclaver (20 mn à 121C)
• liquides a neutraliser à la Javel (12h 2 final
  extemporané)

Libération, congélation de la SA
Préparation et dispensation pharmaceutique
Mise en forme SA PF
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Circuit du médicament
Autorisation de production
Congélation ou Mise en culture
Expansion cellulaire ou transfert de gène
Prélèvement de TA
Ponction de MO
Autorisation de site
Société spécialisée et autorisée
Cellules SA
Libération, congélation de la SA
Préparation de type pharmaceutique
Mise en forme SA PF
Injection au volontaire
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Conclusions

• Produit grade recherche
• Preuve de concept et compréhension du mode
  daction (Pharmacologie)
• Développement et validation des techniques
  caractérisation, identité, activité et
  fonctionnalité
• Test in vivo validation du modèle animal,
  efficacité et effets secondaires (pré
  toxicologie)
• Produit grade Pré-GMP
• Pharmacologie essentiellement in vitro sinon a
  intégrer aux études de toxicologie in vivo
• Tumorogénicité des MTI de TC et TG ex vivo,
  mutagénèse insertionnelle en TG
• Biodistribution des vecteurs et des cellules
• Toxicologie des vecteurs ou du transgène
• Produit grade Clinique
• Circuit du médicament confinement, délivrance,
  stabilité courte
• Circuit du patient prélèvement, injection,
  hospitalisation
• Suivi des patients effets adverses,
  confinement, fluides biologiques, destruction

26
(No Transcript)