Estudo do complemento

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Estudo do complemento
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O sistema do complemento
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Testes funcionais do complemento (I)

• CH50
• Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos
  de carneiro sensibilizados com anticorpo de
  coelho anti-eritrócitos de carneiro
• Diluições seriadas de soro teste são misturados
  com igual volume dos eritrócitos sensibilizados e
  incubados a 37ºC
• A reacção é parada com PBS frio
• A lise é estimada pela hemoglobina por
  espectrofotometria
• Comparação com 0 de lise (sem soro) e 100 lise
  (por acção de água pura).
• Actividade do complemento dada pela diluição
  necessária para obter 50 de lise. Resultado
  expresso pelo inverso desta diluição em unidades
  de CH50/mL soro.
• Resultado baixo pode significar deficiência ou
  consumo
• Heterozigotos têm habitualmente valores
  normais-baixos de CH50

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Testes funcionais do complemento (II)

• AH50
• Semelhante ao CH50, por se basear na
  quantificação da lise de eritrócitos
• Baseia-se no facto de a via alterna ser activada
  por e provocar a lise de eritrócitos de coelho
• Activação da via clássica inibida por quelatação
  do Ca2 com EGTA
• A maior parte das deficiências de C3 por consumo
  são devidas à activação da via alterna, devido ao
  ciclo de amplificação do C3

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Testes funcionais do complemento (III)

• Outros
• ELISA
• Detecção do componente terminal da cascata de
  activação clássica
• C5b-6-7-8-9
• Medida de lise de liposomas contendo enzimas
• Utiliza processos automáticos de quimica clínica

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Testes funcionais do complemento (IV)

• Testes funcionais para componentes do complemento
• Fazer CH50 ou AH50 com
• Complementação por soros deficientes num
  componente
• Complementação com componentes puros

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Testes quantitativos do complemento

• Quantificação de proteínas do complemento
• Identificação das deficiências
• Quantificação de produtos de hidrólise do
  complemento
• Diferenciação entre deficiência e consumo
• C4a/C4 ou C4d/C4gt via clássica
• Bb gt via alterna
• C3a e C5a gt via final (mas têm curtas
  semi-vidas, pelo que a Protein S é uma melhor
  alternativa)
• Nefelometria

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(No Transcript)
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Colheitas

• Má colheita gt deficiência de complemento
• Evitar gt2 ciclos de congelação/descongelação
• Soro com crioglobulinas tem que ser testado de
  imediato
• Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar coagular
  (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar
  a 70ºC
• Tempo excessivo de espera origina deficiência (as
  proteases celulares degradam as proteínas do
  complemento)
• Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e
  particulas activam o complemento in vitro
  provocando falsa deficiência
• Hemólise interfere na leitura

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Análise Genética do C4
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O Gene do C4 localiza-se no MHC-III
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O gene do C4

• dois genes
• C4A (ácido)
• C4B (básico)
• 6p21.3
• 41 exões
• intrão 9 tem 7 Kb
• Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb
• Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb.

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Os Módulos RCCX

• Módulo RCCX
• RP1
• C4
• CYP21
• Tenascin X
• Normalmente 2 módulos em tandem
• RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB

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Os alelos C4A e C4B

• C4B
• o aminoácido nucleofílico (His) ataca o grupo
  tiol de um resíduo de cisteína, formando um
  intermediário acídico
• C4A
• a asparagina, não sendo nucleofílica não origina
  a formação do intermediário pelo que a reacção de
  ligação ás outras moléculas é mais lenta

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TaqI - RFLP (quantificação dos elementos RCCX)
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Taq I e pshA I RFLP
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Imunofixação de C4A e C4B
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(No Transcript)
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Determinação de fenótipo C4
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PFGE para genotipagem C4

• M S gt 75Kb L gt 85Kb
• B LS gt 105Kb LL gt 115 Kb
• T
• LSS gt 135 Kb
• LLS gt 140 Kb
• LLL gt 150 Kb

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Número de módulos RCCX
RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB