Electroforesis de Agarosa

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Electroforesis de Agarosa

• José A. Cardé, PhDLab Biol 3306-GenéticaUniversi
  dad de Puerto Rico-Aguadilla

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Objetivos

• Luego de haber completado el ejercicio, los
  estudiantes estarán capacitados para 
• 1. Distinguir entre una electroforesis utilizando
  geles de poliacrilamida y una electroforesis
  utilizando geles de agarosa.
• 2. Explicar los diferentes parámetros que
  influyen en la separación de los fragmentos de
  DNA.
• 3. Preparar un gel de agarosa y separar
  fragmentos de DNA en el mismo.
• 4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de
  DNA productos de la digestión con endonucleasas
  de restricción.

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Introducción
ELECTROFORESIS
Separación y análisis de macromoléculas (Proteína
s, ADN/ARN) en una matriz gelatinosa al
aplicarles un campo eléctrico
Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948)
Moléc. ? cátodo (-) Moléc. - ? ánodo ()
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Factores que afectan la moVilidad
1 Campo eléctrico Diferencia de potencial
(V-voltios) bajo voltaje (10-500 V) Intensidad
(A-amperios) flujo de carga eléctrica. -
depende de V y de R. - Resistencia determinada
por el soporte.
2 Muestra Carga o densidad de carga carga
eléctrica/masa de la molécula Tamaño debido al
poro de la matriz. Forma forma globular vs
lineal avanza más.
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Factores que afectan la mobilidad
3 Amortiguador - pH determina el grado de
solvatación y la carga de las moléculas generalm
ente es ligeramente básico ? moléculas - -
Fuerza iónica generalmente 0.05 o 0.1 M para
que no interfiera
4 Soporte o Matriz - Adsorción - Porosidad
molecular - inversamente proporcional a la
concentración
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Matrices Electroforéticas

• Características
• Gel poroso (tridimensional interno).
• Tiene que permitir el paso de moléculas.
• NO puede estar cargado.

Matriz del gel
Tipos de Soporte (no restrictivo o restrictivo)
no restrictivo (grupo I) papel, almidón, agar,
acetato de celulosa. poro gtgtgt
proteínas. separación sólo por CARGA
restrictivo (grupo II) acrilamida
poros proteínas separación por CARGA y
TAMAÑO
restrictivo (grupo II) acrilamida,
agarosa poros moléculas de DNA/RNA
separación sólo por TAMAÑO
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PAGE Gel de PoliacrilamidaProteinas 0 ácidos
Nucleicos
Soporte (restrictivo) Geles de Agarosa ?
moléculas grandes (0.1-60 kpb) Geles de
Poliacrilamida ? moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis vertical
Ventajas Gran poder de resolución por CARGA y
por TAMAÑO. Químicamente inertes.
Transparentes (densitograma). Estables (pH,
fuerza iónica, temperatura). Versatilidad en
cuanto al tamaño de poro.
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PAGE Gel de Poliacrilamida

• Aplicaciones
• Separar proteínas
• Determinar peso molecular de una proteína
• Separar proteínas en función de su pI
• Ver si hay una proteína en concreto

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Gel de Agarosa ácidos Nucleicos
Soporte (restrictivo) Geles de Agarosa ?
moléculas grandes (0.1-60 kpb) Geles de
Poliacrilamida ? moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis horizontal (agarosa)
Separación por TAMAÑO Densidad de carga igual
para todas las moléculas por los grupos
PO4- Buena separación, pobre resolución
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Geles de Agarosa

• Aplicaciones
• Separar, identificar y purificar fragmentos de
  DNA o RNA.
• Determinar tamaño de un fragmento de DNA.
• Separación de cromosomas enteros
• Secuenciación de DNA.
• Identificación de regiones de unión a proteínas.
• Detectar la presencia de un gen (o secuencia
  específica de DNA) en una muestra.
• Determinar si se expresa un gen específico

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Geles de Agarosa
Electroforesis horizontal
1. Preparar el gel. 2. Aplicación de la
muestra. 3. Electroforesis. 4. Detección por
tinción con Bromuro de Etidio (BrEt) se
intercala en el DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia.
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Southern Blot
Interacción DNA-DNA (complementación).
Detectar en una mezcla de DNAs una secuencia de
DNA específica (muy sensible). Detectar la
presencia de un gen, etc.
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Northern Blot
Interacción RNA-DNA (hibridación). Detectar
en una mezcla de RNAs una secuencia de RNA
específica (muy sensible). Expresión génica.
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Determinación de Peso Molecular

• Marcadores de peso molecular
• Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de
  las que conocemos el peso molecular.
• Por comparación y extrapolación podemos
  averiguar el PM de nuestra proteína.

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Peso Molecular Como determinarlo?

• Es necesario correr, junto a las muestras de
  interés un marcador molecular estándar.
• Este posee de 5 a 10 fragmentos de DNA a los
  cuales se les conoce el peso molecular.
• Existe una relación lineal entre el logaritmo del
  
• peso molecular de las moléculas y la distancia
  recorrida en el gel.
• Se crea una curva estándar con distancia de
  migración en X y el log10 del peso molecular de
  los fragmentos de DNA en Y
• Usando esa curva extrapolar el peso molecular de
  aquellos fragmentos de DNA en estudio.

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Para crear la curva estándar es
necesario  1)   Medir la distancia desde el
punto de partida (fosas) del marcador hasta cada
una de las bandas observadas en el marcador.
Estos van en el eje de X. 2)   Determinar el
log10 del peso molecular de los fragmentos de DNA
que se encuentran en el marcador estándar. Estos
van en el eje de Y. 3) Unir los puntos con un
best fit line 4)   Utilizar la distancia
recorrida por las muestras desconocidas y
extrapolar a la línea recta, determinar el log 10
del peso y buscar el log inverso para determinar
tamaño en bp.
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Gel de Agarosa Peso Molecular
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Preparacion de Gel

• Preparación del gel de agarosa al 1
• Pesar 0.5-0.8 g de agarosa y colocarlos en un
  matraz de 200
• Añadir 50-80 ml de amortiguador de la corrida
  (TBE 1X), se verá turbia.
• Cubrir el matraz con un pedazo de papel de
  aluminio (o saran wrap) para evitar la
  evaporación al calentar.
• Calentar la mezcla hasta que se disuelva la
  agarosa (hornillas, microondas), se verá
  transparente.
• 5. Remover el matraz y dejarlo enfriar hasta
  65 ºC.
• Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml).

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Preparación de la camara y la Gel

• 1. Limpiar y secar el molde y la cámara para
  la gel.
• Sellar molde para la gel con cinta adhesiva, o
  según recomienda el fabricante. Asegurarse que
  este bien bien sellada
• Verter la agarosa (previamente derretida, ahora
  tibia) en el molde de electroforesis previamente
  preparado.
• Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml).
  Colocar el peine.
• Esperar 15-20 min a que se solidifique,
  colocarla en la cámara de amortiguador.
• Remover el peine y los sellos.
• Añadir buffer de corrida (TBE/TAE) hasta cubrir
  los pozos completamente.

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Preparación de Muestra

• Preparación de la Muestra
• Coloque 20 µl de la muestra de DNA cortado con
  las endonucleasas de restricción en un microtubo
  de 500 µl.
• Añada la cantidad predeterminada de de
  amortiguador de la muestra (loading buffer) al
  mismo tubo.
• Coloque 10 µl de la muestra del DNA sin cortar
  con las endonucleasas de restricción en un
  microtubo de 500 µl. Añada la cantidad
  predeterminada de amortiguador de la muestra.
• Coloque 5-7 µl de DNA estándar.
• Sedimente las mezclas centrifugando por 30
  segundos.
• Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a
  colocar las muestras en el gel.

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Servir muestras y corrida

• Usando pipetas de 2-10 o de 10-100 servir las
  muestras en el orden predeterminado
• Moléculas estándar en carriles estratégicos
• Muestras desconocidas en carriles
  correspondientes
• Colocar la tapa del tanque de electroforesis y
  conectarla a la caja de electricidad. Verificar
  que los polos estén correctamente conectados. 
  Encender la caja.
• Correr la electroforesis a 50-80 V por 40- 75
  minutos.

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Observación de Resultados

• Apagar la caja de electricidad.
• Remover la gel cuidadosamente
• Observarla sobre lámpara luz ultravioleta,
  fotografiarla.
• Utilizando una regla, medir las bandas para luego
  preparar la curva de log10 del peso molecular vs
  distancia.
• Descartar buffer y la gel de acuerdo a las
  medidas correspondientes.

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preguntas

1. Que es resolución? Como se mejora en una gel?
2. Como se cambia el tamaño del poro en una gel?
3. Cuales son los componentes del buffer de corrida?
   Su importancia?
4. Cuales son los componentes del buffer de muestra?
   Su importancia?
5. Cual es el uso del los marcadores estándar de
   peso molecular?
6. En que se parecen y en que difieren el Southern
   Blot del Northern Blot? Que pregunta de
   investigación contesta cada uno?

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Referencias

• Alberts, et, al., (2014). Essential Cell Biology,
  3rd Ed, Garland Science Publishing. New York.
• Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis
  Principles. (Quinta Edición). New York,
  McGraw-Hill Companies, Inc.
• Electrophoresis at DNA Learning Center, Cold
  Spring Harbor Laboratory (Animation)
• Agarose Gel Electrophoresis of DNA at Colorado
  State University
• Agarose Gel Electrophoresis of Plasmid DNA at
  Addgene
• Agarose Gel Electrophoresis (PDF)
• Agarose Gel Electrophoresis in You Tube by BioRad
  Laboratories