Sin t

1
15. Propiedades de las proteínas
2
Titulación ácido-base de una proteína
Carga negativa neta
pI
Carga positiva neta
3
Grupos disociables de una proteína
(Se indica el pKa de la cadena lateral en cada
caso)
Ácidos (aniónicos, - ) Asp
3.86 Cys 10.78 Glu 4.25 Tyr 10.07
Básicos (catiónicos, ) Arg 12.48 His
6.00 Lys 10.53
Aniónicos carga negativa neta por encima de su
pKa Catiónicos carga positiva neta por debajo
de su pKa
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Proteínas ácidas punto isoeléctrico (pI)
inferior a 7 Ricas en Asp y Glu al pH celular
presentan carga negativa neta. Proteínas
básicas punto isoeléctrico (pI) superior a
7 Ricas en Arg y Lys al pH celular
presentan carga positiva neta.
En el medio biológico, son, por lo general, más
abundantes las proteínas ácidas.
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Electroforesis
Muestra
1. Se realiza sobre un soporte sólido o
semisólido, para mini- mizar efectos de difusión
2. Se somete el conjunto a un campo eléctrico
constante, a un pH fijo las proteínas
migran conforme a su carga eléctrica
-

3. Terminada la carrera electro- forética, las
proteínas se tiñen con un colorante
adecuado (p.e., Azul de Coomassie)
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Muestra tres componentes mezclados
Fundamento de la cromatografía
Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria
Fase estacionaria
Se hace fluir una fase móvil sobre la estacionaria
Dependiendo de la afinidad relativa por ambas
fases, los componentes de la mezcla primitiva se
separan
Fase móvil
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Tipos de cromatografía
1. Intercambio iónico - Separa según carga
eléctrica - Fase estacionaria grupos cargados
unidos a un soporte insoluble - Fase móvil
gradiente de sal o de pH 2. Partición - Separa
según solubilidad en solventes - Fase
estacionaria Un solvente sobre un soporte
sólido - Fase móvil El otro solvente fluyendo
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3. Afinidad - Separa según la afinidad de la
proteína por un ligando inmovilizado - Fase
estacionaria ligando unido a soporte
insoluble - Fase móvil (1) solución sin ligando
(2) solución con ligando libre 4.
Hidrofóbica - Separa según hidrofobicidad -
Fase estacionaria grupos hidrofóbicos unidos a
un soporte insoluble - Fase móvil gradiente
inverso de sal 5. Exclusión molecular - Separa
según tamaño molecular - Fase estacionaria
dextrano o agarosa entrecruzados - Fase móvil
solución tamponada
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Intercambio iónico
-
Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico
A baja concentración de sal, se desprenden las
proteínas menos electronegativas
A mayor concentración de sal se desprenden las
proteínas más electronegativas
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Soportes cromatográficos
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(No Transcript)
12
(No Transcript)
13
Cromatografía de intercambio iónico
14
Cromatografía de adsorción a colorantes
15
Cromatografía de afinidad
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Solubilidad
pI
pH
Punto isoeléctrico
17
Solubilidad
Salting out
Salting in
Fuerza iónica, (M)
18
Solubilidad, g/L
100
0
0
100
Temperatura, ºC
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Peso molecular de las proteínas
1. Métodos primitivos presión osmótica,
ultracentrifugación analítica, etc. 2.
Cromatografía de exclusión molecular 3.
Electroforesis SDS-PAGE 4. Cálculo directo a
partir de estructura primaria
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Cromatografía de exclusión molecular
21
(No Transcript)
22
Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)
23
-
-


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Método de Kjeldahl
Digestión ácida total de la proteína y
conversión cuantitativa de nitrógeno a NH3, que
se valora por titulación. Poco sensible. En
desuso. Se sigue empleando para análisis
elemental (p.e., alimentos)
Proteína total N x 100/16
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Absorción a 280 nm
Se fundamenta en la absorción a 280 nm
producida por los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr
y Trp - Sensible y fácil de practicar - Requiere
soluciones puras de proteína no es aplicable a
mezclas - Distintas proteínas dan diferente grado
de absorción, dependiendo de su contenido en
aa. aromáticos
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Al tratar con Cu en medio alcalino, los
compuestos con grupos -CO-NH- dan una coloración
violeta. Muy específica relativamente poco
sensible
Reacción del biuret
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Método de Lowry
Reacción en dos fases 1. Reacción del biuret 2.
Tratamiento con reactivo de fenoles de
Folin-Ciocalteu - Muy sensible (muestras de 10
mg) y sencillo - Resultados variables con
distintas proteínas, pues depende del contenido
en aminoácidos aromáticos
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Método de Bradford
La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a
una proteína modifica las características de
absorción visible de aquél. Sensible, fácil de
practicar y resultados muy constantes
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