Metodi di studio

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Metodi di studio
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(No Transcript)
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Il primo microscopio otticoUn microscopio
semplice Hooke, 1665
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Un moderno microscopio
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Microscopi ottici da esercitazione
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Anatomia di un microscopio
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Anatomia di un microscopio
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Anatomia di un microscopio
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Anatomia di un microscopio
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Microscopia Ottica
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Microscopia Ottica
OSSERVAZIONI A FRESCO

• Prime osservazioni
• Il preparato si deteriora velocemente
• Poco informative
• Descrizioni brevi ed inesatte

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Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata
Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di
acqua o soluzione fisiologica
Il materiale da osservare viene posto sulla
goccia ed osservato
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Preparati in campo chiaro
Un batterio Campo chiaro, 1000x
Cellule
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Microscopia Otticaa Contrasto di fase

• Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco
  contrasto
• Per migliorare le immagini è possibile sfruttare
  le lievi differenze di indice di rifrazione del
  materiale da osservare rispetto al mezzo
  circostante
• Applicando nel condensatore delle variazioni di
  fase alla luce che raggiunge il preparato e
  applicando variazioni opposte nellobiettivo
• I raggi luminosi che sono stati modificati
  generano fenomeni di interferenza che rendono più
  chiari o più scuri gli oggetti illuminati

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Microscopia Ottica a Contrasto di fase
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Un batterio 400x
Un lievito (S. cerevisiae) 400x
Una muffa (G. candidum) 400x
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Osservazione in campo scuro
Un particolare tipo di condensatore
nellosservazione in campo scuro consente di
deviare i fasci di luce in modo che le lenti
frontali dellobiettivo siano attraversati
soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi
dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su
uno sfondo scuro. In questo modo è possibile
osservare oggetti anche al di sotto del potere di
risoluzione del microscopio ottico
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Osservazione in campo scuro
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Uso di colorazioni per migliorare il contrasto
dei preparati

• Utilizzando diverse classi di coloranti è
  possibile migliorare il contrasto delle immagini
  al microscopio
• Coloranti vitali
• Le cellule possono essere colorate senza
  fissazione e sono quindi solo minimamente
  alterate dal trattamento
• Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti
  per colorare selettivamente specie diverse o
  strutture cellulari diverse
• Coloranti che richiedono fissazione
• Le cellule devono essere disidratate prima della
  colorazione, con possibile alterazione delle
  strutture cellulari e della forma delle cellule

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Preparazione di un Campione Biologico per la
Microscopia Ottica

• Acquisizione del campione e taglio in pezzi
  (1cm3)
• Biopsia, intervento chirurgico, autospia
  postmortem
• Prelevato rapidamente utilizzando strumenti
  adatti (bisturi)

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• Fissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere"
  e preservare)
• Generalmente per mezzo di aldeidi reattive
  (formaldeide)
• Cross-link delle macromolecole, in particolare le
  proteine
• Si ottiene un effetto indurente sui tessuti
  "molli"
• Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli
  enzimi persenti degradino il tessuto

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• Disidratazione del campione attraverso passaggi
  in soluzioni a concentrazione crescente di
  etanolo
• Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non
  è solubile in H2O
• Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene
• Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

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• Inclusione del campione in in mezzo appropriato
  paraffina o resina
• Tessuti sono "molli" e fragili
• Diversi passaggi in paraffina calda
• La paraffina occupa lo spazio precedentemente
  occupato dall'H2O
• La paraffina fredda si indurisce e permette di
  sezionare il campione

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• Taglio per mezzo di un microtomo, che produce
  sezioni dello spessore di 1-10 mm
• Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia

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• Colorazione delle sezioni con il metodo più
  appropriato
• I coloranti sono a base acquosa, per cui si
  elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo

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Colorazioni

• Colorazione
• Con un colore brillante di certe componenti del
  tessuto
• Contro colorazione
• Del resto del tessuto con un colore contrastante

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Ematossilina/Eosina

• Ematossilina
• Ha affinità per le molecole cariche negativamente
  (DNA, RNA ed alcune proteine)
• Eosina
• Ha affinità per le molecole cariche positivamente
  (proteine del citosol)

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Perchè questa "slide" è blu

• Se una porzione di tessuto o di una cellula si
  colora di blu/porpora, viene detta basofila
• È colorata dall'ematossilina
• Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili

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e questa rossa ?

• Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa,
  viene detta acidofila o eosinofila
• È colorata dall'eosina
• Sono le proteine del citosol

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Altre colorazioni

• PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff)
• Per sostanze ricche in zuccheri (muco)
• Tricromica o Hazan-Mallory
• Per i tessuti connettivi
• Le fibre si colorano in blu
• Con EE sono rosa

Adiposo Bianco
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• Osmio o Sudan black
• Per grasso/lipidi/mielina
• I lipidi non incorporano coloranti acquosi
• Argento ed oro
• Per fibre delicate e processi cellulari
• Giemsa
• Per le cellule del sangue
• Simile ad EE

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E le aree "bianche"?

• I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi
  interstiziali non si colorano con EE
• Sangue, linfa etc.
• Si riconoscono come ampi spazi bianchi
• Anche i lipidi ed il grasso non si colorano

Mesenchima
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Interpretate il campione !!!

• Dovete pensare in 3 dimensioni
• Sezioni seriali sono l'ideale per
  l'interpretazione e la ricostruzione

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Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali
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Artefatti

• Shrinkage
• Lascia dello spazio aggiuntivo
• Disidratazione e fissaggio
• Fratture al piano di taglio
• Tagli netti e ben visibili
• Lama deteriorata

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• Colorante precipitato
• Macchie di colore a "grano di pepe
• Tessuto "pinzato"
• Strumento per l'excisione deteriorato
• Durante o dopo il sezionamento
• Pieghe
• Durante il montaggio

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(No Transcript)
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Microscopia Elettronica
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(No Transcript)
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Microscopia Elettronica a Trasmissione

• Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta
• Alta risoluzione
• Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi
• Gli elettroni passano attraverso il campione

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La maggiore risoluzione del TEM permette di
visualizzare strutture non visibili con il
microscopio ottico Risoluzione dell'occhio 0.2
mm 200 µm Risoluzione del MO 200 nm 2,000
Angstroms Risoluzione del TEM 2 Angstroms 1 mm
1000 µm 1 µm 1000 nm 1 nm 10 Angstroms
Pinocitosi
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Preparazione di Campioni Biologici per TEM

• Acquisizione del campione e taglio in pezzi
  (1cm3)
• Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi
  tetrossido di osmio
• Losmio è un metallo pesante che si lega ai
  lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)
• Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni
  appaiono chiari

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• Disidratazione dei campioni tramite passaggi in
  soluzioni a concentrazione crescente di etanolo
• Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di
  resina
• Taglio dei campioni inclusi con un
  ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a
  volte vetro)
• La superfice da analizzare deve essere di circa
  0.2 mm
• Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm
  (di solito 65-80 nm)

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• Montaggio delle sezioni su di una griglia
• Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato
  di uranile e citrato di piombo
• Visualizzazione al TEM
• Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Freeze-fracture

• Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150
  C
• Con un martelletto viene provocata la frattura,
  secondo le linee di forza del tessuto
• Evaporazione e deposizione di metalli pesanti
• Eliminazione materia organica

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Autoradiografia
Utilizzando isotopi radioattivi si possono
marcare strutture cellulari ben definite e
visualizzarle poi tramite microscopia ottica od
elettronica
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Ottico Elettronico
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Microscopia Elettronica a Scansione

• SEM fa una scansione della superfice del campione
• Produce immagini 3-D

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Preparazione dei campioni per SEM

• Acquisizione del campione
• Trattandolo con cura in modo da non danneggiare
  la superficie
• Fissazione e disidratazione
• Non si include

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• Poggiato su di un supporto e ricoperto con un
  metallo
• Oro, cromo, palladio, carbone
• Deve essere elettron-conducente (non
  elettrondenso)
• Visualizzato al microscopio
• Fotografato
• Si possono analizzare le componenti chimiche
  tramite raggi X

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Microscopia a Fluorescenza

• Il campione viene colorato con anticorpi oppure
  sostanze specifiche coniugate con fluorocromi
• La luce utilizzata ha lunghezze donda specifiche
  per eccitare i fluorocromi
• I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o
  verde

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Microscopia a Fluorescenza
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Microscopia Confocale

• La luce monocromatica, di lunghezza donda breve,
  è emessa da una sorgente laser, attraverso un
  diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che
  permette il passaggio di determinate lunghezze
  donda
• Le lenti dellobbiettivo focalizzano la luce in
  un punto del piano ottico del campione
• I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati
  ed emettono a lunghezza donda maggiore, in grado
  di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel
  piano del diaframma
• Il foto-moltiplicatore amplifica lintensità del
  segnale e lo trasmette al computer che elabora
  limmagine
• La luce che proviene dai piani superiori o
  inferiori al piano focale non passa attraverso il
  diaframma e non contribuisce alla formazione
  dellimmagine
• Diversi punti dello stesso piano e dei paini
  consecutivi vengono illuminati e registrati
  mediante la scansione col laser

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(No Transcript)
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Metodi analitici
Come si analizzano gli organelli o la struttura
fine? Metodiche che permettono lisolamento dei
componenti cellulari intatti Centrifugazione,
semplice o differenziale Permette lisolamento
sia delle cellule da un tessuto sia delle singole
componenti cellulari
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Centrifugazione
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Centrifugazione differenziale