Mikrobioloski preparati

1
Mikrobioloski preparati
2
Mikrobioloski preparati

• mikrobioloske preparate pravimo u cilju
  posmatranja MO (morfologija, struktura, oblik,
  raspored celija, pokretljivost)
• Preparat moze da bude
• Nativni preparat - posmatranje zivih MO
• Fiksirani preparat

3
Nativni preparat

• posmatranje zivih MO (pokretljivost)
• nedostatak-slaba vidljivost, mogucnost infekcije,
  jednokratna upotreba
• procedura pripreme
• Na predmetnicu se stavlja uzorak (u slucaju tecne
  kulture stavlja se kap suspenzije, u slucaju
  cvrste podloge u kap vode unosi se materijal iz
  kulture)
• Pokrovnica
• mikroskopiranje

4
Fiksirani preparat

• prednosti-visekratna upotreba, ne postoji
  mogucnost infekcije, posmatranje strukture,
  oblika i morfologije
• procedura pripreme
• Nanosenje suspezije na predmetnicu i pravljenje
  razmaza
• Susenje na vazduhu
• Fiksiranje (provlacenjem kroz plamen) kako bi
  ubili MO i fiksirali ih za predmetnicu
• Bojenje preparata
• Mikroskopiranje

5
Pravljenje razmaza
6
Fiksiranje preparata
7
Bojenje preparata

• Prosto bojenje - koristi se 1 boja
• -uocavanje oblika i rasporeda celija
• -boje koje se primenjuju kristal violet,
  safranin,
• metilensko plavo
• Slozeno bojenje - koristi se 2 ili vise boje
• -uocavanje morfologije i strukture celije
• -tipovi slozenog bojenja bojenje po Gramm-u,
  bojenje acido-alkoholrezistentnih bakterija
  ,bojenje kapsula, bojenje endospora , bojenje
  nukleinskih kiselina, bojenje flagela

8
Mikrobioloske boje

• organska jedinjenja koja boje odredjene celijske
  strukture
• Prema poreklu dele se na
• prirodne safranin (safran), lakmus (lisajevi)
• vestacke (anilinske boje)
• soli koje prilikom pravljenja vodenih rastvora
  disosuju
• bazno katjonske boje (kristal violet,
  safranin)
• kiselo anjonske boje, negativno bojenje (eozin)
• neutralno-neutralno crveno

9
Mikrobioloske boje

• Svaka boja mora da sadrzi dve grupe
• hromoformnu (nosilac karaktera boje, NO2)
• auksohromnu (el. disocijacija, OH, NH2)

10
Prosto bojenje

• Procedura
• Pravljenje razmaza
• Susenje (na vazduhu)
• Fiksiranje
• Bojenje
• -kristal violetom (na predmetnicu staviti
  filter hartiju i na nju naneti boju, nakon 1-2
  min ukloniti filter hartiju, preparat isprati
  vodom, osusiti filter hartijom, mikroskopiranje)
• -safraninom-postupak je identican, filter
  hartiju nije neophodno stavljati na preparat pre
  bojenja

11
Procedura prostog bojenja
12
Slozeno bojenje-bojenje po Gramm-u

• 1884. danski histolog Christian Gram razvio metod
  bojenja u cilju diferencijacije bakterijskih
  celija i nukleusa eukariotskih celija
• diferencijalna slika (identifikacija Gr i Gr-
  bakterija)
• na osnovu razlike u gradji cel. zida Gr
  bakterije boje se ljubicasto, dok se Gr-
  bakterije boje crveno
• metoda se zasniva na sukcesivnoj primeni
• kristal violeta (osnovna boja)
• lugola (ucvrscivac) rastvor I u KI
• etanola (obezbojivac) 70 ili 95
• safranin (suprotna boja)

13
Procedura bojenja po Gramm-u

• Nakon pravljenja razmaza, susenja na vazduhu i
  fiksiranja pristupa se proceduri bojenja
  preparata
• bojenje kristal violetom 1-2 min (neophodno je
  staviti na preparat filter hartiju)
• lugol 1-2 min
• ispiranje vodom
• ispiranje etanolom 5-10 sec
• ispiranje vodom
• bojenje safraninom 1-2 min
• ispiranje vodom, susenje filter hartijom,
  mikroskopiranje

14
Procedura bojenja po Gramm-u
15
Procedura bojenja po Gramm-u
nakon pravljenja razmaza, susenja na vazduhu i
fiksiranja pristupa se proceduri bojenja preparata
inicijalno se boje kristal violetom kako Gr tako
i Gr- bakterije
u reakciji kristal violeta i joda obrazuje se
nerastvorljivi kompleks
Gr bakterije imaju deblji mureinski sloj u
celijskom zidu, nepropustljiv za alkohol i boje
se ljubicasto
Gr- bakterije imaju tanji peptidoglikanski sloj u
celijskom zidu, propustljiv za alkohol koji
rastvara i izvlaci kompleks boje i joda
16
Sporulacija

• neke bakterije tokom rasta, procesom sporogeneze
  formiraju endospore
• rezultat nepovoljnih uslova zivotne sredine,
  najcesce u uslovima limitiranosti nutrijentima
  (C, N najznacajniji)
• karakteristike spora odsustvo metabolicke
  aktivnosti, rezistentnost prema fizickim i
  hemijskim ciniocima (t, UV, boje, hemijska
  jedinjenja, susa) zbog prisustva egzosporijuma
  (proteinski omotac)
• u povoljnim uslovima procesom germinacije formira
  vegetativnu celiju
• jedna bakterijska celija najcesce formira samo 1
  sporu
• strukture koje sluze za prezivljavanje, a ne za
  razmnozavanje

17
Sporulacija

• rezistentnost na toplotu pripisuje se
  dehidriranom stanju i kalcijum dipikolinatu
• gradja spore jezgro, zid, korteks, omotac,
  egzosporijum
• proces sporulacije odvija se u najmanje 7 faza
• tipovi sporulacije
• 1. bacilarni-spora manjeg dijametra od celije
  (terminalno, subterminalno ili centralno
  postavljena)
• 2. klostridijalni-spora veceg dijametra od
  celije (centralno ili subterminalno
  postavljena)
• 3. plektridijalni-spora veceg dijametra od
  celije (terminalno postavljena)

18
Bojenje endospora po Schaeffer-Fulton-u

• zbog specificnih fizickih i hemijskih
  karakteristika spore tesko usvajaju mikrobioloske
  boje (uocavaju se kao bezbojne intracelularne
  tvorevine kod prostog i bojenja po Gramm-u)
• zagrevanjem preparata zid spore postaje
  propustljiv za boju, nepropustljivost zida
  omogucava da prilikom obezbojavanja alkohol ne
  prodire u sporu i ona ostaje obojena za razliku
  od drugih vegetativnih oblika bakterija

19
Bojenje endospora po Schaeffer-Fulton-u

• Nakon pravljenja razmaza, susenja na vazduhu i
  fiksiranja, pristupa se bojenju preparata
• Procedura bojenja
• Bojenje malahitno zelenom bojom (5) 2min,
  neophodno je koristiti filter hartiju
• Zagrevanje predmetnice na plamenu 3-5min (boja
  treba da isparava, ali ne da kljuca), kada ispari
  veci deo boje doda se nova kolicina
• Ukloniti filter hartiju i ispirati vodom
• Bojenje safraninom 3-5min
• Ispiranje vodom, susenje filter hartijom,
  mikroskopiranje
• Spore se boje zeleno, a vegetativne celije crveno

20
Procedura bojenja endospora
21
Primeri prostog i slozenih bojenja