COLTURE CELLULARI

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COLTURE CELLULARI

• MDA-MB-435 MCF-7 MCF-10

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(No Transcript)
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LA FISIOLOGIA
Fisiologia Studio delle funzioni vitali a vari
livelli di complessità
Funzione (Fisiologia)
Struttura (Anatomia)
- Livello Molecolare - Livello Cellulare -
Livello dei tessuti - Livello di organo - Livello
di Sistemi di organi - Livello di organismi -
Livello di popolazione
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(No Transcript)
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Coltura Cellulare Abbesi-Impiombato, S 1992.
Biochimica Clinica 16(10)957-969
Differenze principale fra In Vivo e In Vitro Il
sistema passa da architettura 3-D a 2-D In Vitro
perde interazione tessuto specifica Incremento In
Vitro di frazione cellulare in crescità Metabolism
o più alto In Vitro In Vitro perde regolazione
sistemica(endocrin nerv)
Vantaggi di Coltura Cellulare Controllo di
ambiente fisico-chimico Risposta
rapida Omogenizzazione e caratterizzazione di
cellule/tessuto
Svantaggi di Coltura Cellulare Senza esperienza è
difficile Molte cellule sono necessarie ed il
costo è alto Cellule possono cambiare
caratteristiche col tempo
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• Tipi di colture cellulari
• Colture primarie cellule ottenute direttamente
  dalla dissociazione di tessuti
• Vantaggio
• -Cellule molto simile al tessuto di origine
• Svantaggio
• -Cellule molto simile al tessuto di origine
• -Piccole quantità sono disponibili
• -Sterilità è difficile
• Colture secondarie Linee cellulare stabile di
  cellule immortalizzate spontaneamente o con virus
• -Possono essere cresuite per molte generazioni e
  in grande quantità
• -Le cellule sono molto simile da esperimento a
  esperimento

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• COLTURE PRIMARIE
• L'solamento delle cellule da tessuto si può
  ottenere mediante varie metodiche, ad es.
• A)
• Fluorescence activated cell sorter (FACS)
• B)
• omogeneizzazione meccanica del tessuto
• incubazione in terreno di coltura fino a che si
  notano gli aloni di crescita
• Tripsinizzazione e piastratura
• C)
• omogeneizzazione meccanica del tessuto
• tripsinizzazione
• Dissociazione e piastratura

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COLTURA DI TESSUTO
CAMERA GESTAZIONALE
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CAMERA GESTAZIONALE
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PRELIEVO DI UN PICCOLO FRAMMENTO DI MEMBRANA
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FRAMMENTAZIONE DI UN PICCOLO PEZZO DI CAMERA
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PRELIEVO DI PARTE DELLA MEMBRANA FRAMMENTATA
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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FIBROBLASTI CRESCIUTI INTORNO AD UN FRAMMENTO DI
TESSUTO
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• Coltura di linee cellulari
• ADERENTI le cellule aderenti solitamente
  crescono fino ad occupare l'intera superficie
  disponibile (coltura confluente). A confluenza le
  cellule devono essere staccate e trasferite in
  nuove fiasche (divisione).
• IN SOSPENSIONE in generale crescono in
  sospensione le linee di origine emopoietica. La
  crescita in sospensione può avvenire in
  condizioni statiche o in agitazione (per produrre
  grandi quantità di cellule).

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• Conservazione di linee cellulari
• Le cellule da conservare sono staccate dalla
  piastra mediante tripsinizzazione, la sospenzione
  cellulare è centrifugata al fine di allontanare
  la tripsina.
• Il pellet cellulare è risospeso nello stesso
  terreno di coltura utilizzato per la crescita
  addizionato con ulteriore 10 di siero fetale
  bovino inattivato e 10 DMSO 100, alla
  concentrazione di 2x106cells/ml
• La sospensione è aliquotata (1ml) in criovials
  sterili e portata lentamente alla temperatura di
  conservazione di 190C
• I batch sono conservati in N2 liquido
• Il batch da piastrare è scongelato lentamente a
  37C e aggiunto al terreno di coltura in fiasca,
  si incuba a 37C in presenza di CO2
• Si cambia il terreno per allontanare il DMSO.

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• Espansione di linee cellulari aderenti
• Quando le cellule raggiungono quasi il 100 di
  confluenza e sono in buono stato vengono staccate
  e divise in due aliquote ed opportunamente
  ripiastrate in due nuove fiasche
• Il monolayer di cellule, dopo 2 lavaggio in PBS
  sterile, possono essere staccate mediante
• Tripsinizzazione si incuba con tripsina (0.25)
  per 2-5min a 37C. Le cellule vengono
  ulteriormente distaccate dal supporto
  manualmente, percuotendo la fiasca e la tripsina
  viene neutralizzata mediante aggiunta di terreno
  di coltura che contiene siero fetale bovino
  inattivato. La sospensione cellulare è divisa in
  2 nuove fiasche.
• Aggiunta di EDTA 0.04 si aggiunge EDTA, che
  chelando il Ca facilita il distacco manuale
  delle cellule. Dopo aggiunta di terreno di
  coltura e centrifugazione a 1000rpm per 5min il
  pellet è risospeso in terreno fresco e
  ripiastrato in 2 nuove fische.

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• Espansione di linee cellulari in sospensione
• Controllare al microscopio che le cellule siano
  in buona salute (quando le colture sono troppo
  concentrate il terreno appare giallo-arancio)
• Contare le cellule e calcolare una divisione tale
  che la concentrazione finale sia di 1-2 x 105
  cellule/ml, a meno che la linea non richieda
  concentrazioni diverse
• Se è necessario, trasferire la coltura in fiasche
  più grandi
• Incubare a 36-38C per 2-3 giorni

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Conteggio delle cellule Il conteggio viene
effettuato al microscopio, con lausilio di uno
speciale vetrino detto Camera di Bürker
cells/ml (abc)/3 x 104
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• Terreni di coltura
• Ogni coltura primaria o secondaria cresce in un
  opportuno terreno di coltura, i diversi terreni
  di coltura differiscono tra loro per il contenuto
  in aminoacidi e sali, e per la concentrazione di
  glucosio.
• I terreni contengono inoltre rosso fenolo, un
  indicatore di pH (rosso-arancio a pH 7.3, giallo
  a pH acido e rosso-viola a pH alcalino).
• Il sistema tampone utilizzato è il
  bicarbonato/acido carbonico. Quest'ultimo deve
  essere fornito alle cellule in forma di CO2
  infatti le cellule sono incubate in presenza di
  CO2.
• Al terreno usualmente vengono aggiunti
• L-glutamina (aminoacido labile)
• Siero fetale bovino (apporta fattori di crescita)
• Antibiotici (gentamicina, penicillino/streptomicin
  a, etc.)
• Elementi specifici per il tipo di cellule
  utilizzato, etc.

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Preparazione del "cocktail" di coltura Le cellule
vengono coltivate in appositi substrati di
coltura, che possono avere dimensioni differenti.
Ogni substrato è caratterizzato da un valore
ottimale di densità cellulare, e pertanto, una
volta determinata la densità della sospensione
iniziale di cellule, si calcola la diluizione da
realizzare per ottenere la densità desiderata.
Piastra cellule
90mm 6x106
60mm 3x106
20mm 1x106
12pz 5x105
24pz 2.5x105
96pz 8000/15000
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• Gestione dell'area sterile
• La pulizia e la perfetta efficienza dell'area
  sterile devono essere controllate costantemente.
• Si accede e si lavora indossando i dispositivi di
  protezione individuali (camice), i guanti
  protettivi (da cambiare spesso).
• I rifiuti biologici e chimici, solidi e liquidi
  prodotti nel laboratorio, devono essere raccolti,
  separati ed eliminati in modo corretto.
• I piani di lavoro devono essere mantenuti puliti,
  inoltre occorre controllare e mantenere la
  pulizia, il buon funzionamento e l'efficienza dei
  vari strumenti (microscopio, pipettatori
  automatici, cappe a flusso laminare, incubatori,
  bagno termostatato, frigorifero, ecc).

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• Procedure di sterilizzazione
• Tutto il materiale utilizzato per lisolamento e
  la coltura delle cellule deve essere sterile, al
  fine di evitare contaminazioni di batteri o muffe
  che possano danneggiare le colture.
• Le soluzioni usate sono preparate con acqua
  sterilizzata mediante autoclavaggio e sono quindi
  filtrate con filtri sterili da 0.2 µm.
• Il siero fetale viene inattivato tenendolo a una
  temperatura di 56C per 30 e poi filtrato con
  filtri sterili da 0.2 µm.
• Il materiale di consumo (piastre, tubi da
  centrifuga, pipette, filtri, siringhe ecc.) è
  acquistato direttamente in confezioni sterili
  monouso.
• La steriltà della cappa è assicurata
  dall'irraggiamento con raggi UV, generalmente
  effettuato per tutta la notte precedente
  allisolamento delle cellule.

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• Preparazione di estratti proteici da cellule in
  coltura
• Dopo 1 lavaggio con PBS sterile, le cellule
  vengono staccate dal supporto dopo aggiunta di un
  buffer di lisi, RIPA (1 triton X-100), al quale
  vengono aggiunti inibitori di proteasi, mediante
  utilizzo di un raschietto,
• Le cellule sono ulteriormente rotte mediante
  sonicazione e la sospenzione è centrifugata a
  10000rpm per 5min.
• Si dosano le proteine totali con il micrometodo
  di Bradford o di Wadden-Hill.
• Le proteine possono essere conservate a 20C.

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Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Pre-trattamento delle Cellule
Un passo importante e spesso ignorato- non è
naturale ma pùo avere un effetto sul resultati
1) Niente 2) Blocco metabolico- stai attento, non
bloccare mai completemente. In differente
parte del ciclo cellulare per iniare tutti
le cellule nello stato identico dello ciclo
(sincronizzazione) che pùo essere utile, per
essempio, per un sostanza che prodotto
solamente in un parte del ciclo
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Applicazioni biologiche delle colture cellulari

• Test di proliferazione (chemiosensibilità)
• Def Incremento di metabolismo cellulare
  accompanato da un aumento in grandeza, numero o
  entrambe
• Trypan Blu Stain
• Crystal violet
• Test MTT
• Cell Proliferation ELISA BrdU
• Test citotossico con incorporazione di
  3H-Timidina
• Citofluorimetria (FCS)
• Cell Death Detection ELISA
• Camera di Boyden o raschio o infiltrazione

• Citotossicità
• Analisi del ciclo cellulare
• Apoptosi
• Motilita/invasione

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Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Proliferazione -Incremento di metabolismo che
pùo essere in un aumento di grandezza delle
cellule, nel numero del cellule o entrambe
Statico- contare il numero di erbe in un campo
-Numero di cellule/superficie
Haeomocytometer Coulter counter
-Misure di essere stanardizato al cellulare
Colorante specifico ai cellule Densità
opticale RNA totale DNA totale Proteina totale
-Parametri del ciclo cellulare (fase S)
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Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Proliferazione
Cinetico- attività delle erbe
-Metabolico
O2consumo/CO2 produzione MTT o simile
-Organico sintesi
Incorporazione di timidina in DNA Incorporazione
di aminoacidi in proteine
-Produzione di proteine associato alla crescità
Citokeratine pS2
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Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Morte Cellulare
Normalmente si lavora con populazione di cellule
La crescita assoluta non è solamente lincremento
di cellule ma deve anche includere misure della
morte di alcune cellule nella populazione
Reale crescita cellulare (lincremento dello
numero di cellule dovuta alla proliferazione) -
(il decremento dello numero di cellule dovuta
alla morte)
Necrosi cellule si rompano con rilascio del
citosol
86Cr LDH
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Applicazioni biologiche delle colture cellulari
Morte Cellulare
Apoptosi (morte cellulare programmato)
Digestione controllato di DNA nucleare a
frammenti di distinti grandeza da nuclitasi
Ca2-dependente. DNA diventa rotto in subunità di
misure esatta (Scala di DNA) e poi è rilasciata
nel citosol
DNA totale o citosolico in un gel 3H-dT or misura
chimica in citosol Anticorpi
Sia necrosi che apoptosi hanno un effetto precoci
sulla viabilità cellulare ed, quindi, il Tryptan
Blue Exclusion Test è un misura facile
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Trypan Blue Stain e Crystal Violet

• Tests di citotossicità
• Principio su cui si basa
• Cellule vitali possiedono membrana cellulare
  selettiva. Cellule morte perdono la capacità
  selettiva
• Cellule in coltura in piastre opportune
• Trattamenti farmacologici
• Trypan Blue
• Preparazione della sospensione cellulare in PBS
• Incubazione per 5-15 del campione con la sonda
  allo 0.4 in PBS
• colora selettivamente le cellule morte
• Conta cellulare tramite camera di Burker
• Valutazione della vitalità cellulare
• (n. cellule vitali/n. cellule totali)X100

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Trypan Blue Stain e Crystal Violet

• Crystal Violet
• Incubazione del campione con la sonda (10 minuti)
• colora selettivamente le cellule vive
• Lavaggi con dH2O
• Una soluzione contenente Na-citrato 0.1M e EtOH
  scioglie il colorante
• Lettura del campione effettuata allo
  spettrofotometro (540nm)
• Semina generalmente effettuata in piastre da 96
  pozzetti
• Lettura con Plate Reader

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Incorporazione di 3H-Timidina
Tests di citotossicità Principio su cui si
basa Capacità della cellula di incorporare
3H-Timidina durante la sintesi del DNA Cellule in
coltura in piastre da 96 pozzi Incubazione per24h
con 3H-Timidina (incorporata al posto della
timidina) Trattamenti farmacologici Incubazione
con miscela scintillante Lettura tramite TOP COUNT
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Cell Proliferation ELISA BrdU
Tests di citotossicità Principio su cui si
basa Capacità della cellula di incorporare BrdU
durante la sintesi del DNA Cellule in coltura in
piastre da 96 pozzi Trattamenti
farmacologici Incubazione per2-24h conBrdU
(incorporata al posto della timidina) Fissaggio e
denaturazione
Tetramethyl benzidine
Anti-BrdU-POD
H2SO2 1M
450nm
BrdU
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Test MTT

• Test di citotossicità
• Principio su cui si basa
• succinato
  deidrogenasi
• Dimethyltiazol-diphenyl- formazano
• tetrazolium-bromide
• Cellule in coltura in piastre da 96 pozzi
• Trattamenti farmacologici
• Incubazione per 30-1h del campione con la sonda
  (0.5mg/ml)
• a 37C e 5 CO2
• Sonda sciolta con DMSO
• Lettura del campione effettuata allo
  spettrofotometro (570nm-630nm)

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Citofluorimetria

• FCS permette di
• analisi quantitativa del contenuto di DNA
• discriminazione di cellule nelle diverse fasi del
  ciclo cellulare
• fasi principali ciclo cellulare
• fase G1 sintesi di fattori indispensabili alla
  crescita
• fase S o di sintesi del DNA
• fase G2 preparazione alla mitosi cellulare
• fase M o di mitosi
• I farmaci producono alterazioni metaboliche su
  vari livelli
• perturbazione del ciclo cellulare

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Citofluorimetria

• Ioduro di Propidio
• Analizza la distribuzione delle cellule con un
  determinato contenuto di DNA allinterno del
  ciclo cellulare
• Si intercala nel DNA a doppia elica
• Forma un complesso stabile che emette una
  fluorescenza rossa quando eccitato con un laser
• Eccitazione proporzionale a contenuto di DNA 
•  

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Citofluorimetria

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Cell Death Detection ELISA
Misura dellapoptosi Principio su cui si
basa Determinazione quantitativa dei frammenti
di DNA associati a proteine istioniche dopo
induzione dellapoptosi Cellule in coltura in
piastre da 96 pozzi Trattamenti
farmacologici Endonucleasi tagliano il DNA a
livello degli istioni I frammenti a doppio
filamento passano nel citosol Lisi della
membrana plasmatica Raccolta del citosol del
campione e centrifugazione Raccolta del
sovranatante
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Cell Death Detection ELISA
405nm
Tetramethyl benzidine
Anti-DNA-POD Mouse Monoclonal Ab
Anti-histone
biotina
streptavidina
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Motilità Cellulare/Invasion
Un aspetto importante è il movimento e/o
invasione di cellule
Come primo passo cè il stimolo di cambiare forma-
si pùo fissare le cellule in gluteraldehyde,
colorare e guardare la tendenza di cambiare forma
La cellula poi comincia di spostarsi misuare in
camera speciale BOYDEN CHAMBERS La substrato
messo sul filtro e i sostanze dal altra lato del
filtro sono importante (chemio-attrente)
Invasione non è solamente il movimento ma anche
la digestione del matrice extracellulare per
permettersi di attraversarla. Quindi, luso di un
matrice che non pùo essere attraversato
senza digestione è una misure del invasione
Molti usano la rilascio di proteasi
extra-cellulare come un misure di invasione.
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Motilità Cellulare/Invasion
Misure di Chemotaxis, Haptotaxis e Invasione In
Vitro
La differenza fra questi sono il tipo di matrice
applicato sul filtro che separa i due
compartimenti della Camera di Boyden
Chemotaxis semplice gelatina che aiuta
ladesione delle cellule ma non è una barriera né
unagente stimolante. Le cellule semplicemente
migrano verso un gradiente chimico definito
Haptotaxisil filtro è coperto di sostanze che
non creano una barrierama stimolano ladesione e
il movimento. Es fibronectina, laminina e
collagene IV
Invasione si copre il filtro con un estratto
ricostituito di complesso extracellulare
(MATRIGEL) che dà una barriera sia fisica che
chimicache le cellule devono attraversare quando
stimolate da un gradiente chimico
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Le macromolecole che costituiscono la matrice
extracellulare sono secrete localmenete dalle
cellule presenti nella matrice stessa
prevalentemente dai fibroblasti (condroblasti e
osteoblasti)
Le due pricipali classi di macromelcole
extracellulari che compongono la matrice sono
1- Catene polisaccaridiche chiamate
GLICOSAMMINOGLICANI (GAG) che si legano alle
proteine a formare i PROTEOGLICANI 2- Proteine
fibrose appartenenti a due gruppi A- funzione
strutturale COLLAGENO ed ELASTINA B- funzione
adesive FRIBRONETTINA e LAMININA
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Motilità Cellulare/Invasion
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Motilità Cellulare/Invasion
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Motilità Cellulare/Invasion
Wound Healing (Raschio)
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Motilità Cellulare/Invasion
Infiltrazione di cellule tumorali in un monolayer
confluente di cellule normali
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Motilità Cellulare/Invasion
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Motilità Cellulare/Invasion
STRUTTURE INVASIVE
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Motilità Cellulare/Invasion
FITC-GEL
GELATINABSA-BODIPY
La fluorescenza del Bodipy è quenchata al 95
nella BSA non digerita
Gelatina contenente BSA che lega 16 molecole del
fluoroforo BODIPY
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Motilità Cellulare/Invasion