Trasporti attraverso la membrana

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Trasporti attraverso la membrana Proteine di
trasporto
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Una membrana costituita da un puro bilayer
fosfolipidico è impermeabile alle proteine e alla
maggior parte delle piccole molecole
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Proteine di trasporto
2 principali classi di proteine di trasporto
Proteine Carrier
Proteine Canale
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Diffusione Facilitata
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Caratteristiche dei trasporti mediati

• I carriers sono dotati di specificità
• Sono soggetti a saturazione
• Possono essere bloccati dagli inibitori
  competitivi
• Hanno unelevata dipendenza termica e dal pH

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I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi

• I carriers agiscono cataliticamente come gli
  enzimi
• Legano selettivamente il loro substrato, cioè
  la
• molecola che deve essere trasportata
• Cambiano di conformazione per rilasciare il
• substrato dallaltro lato
• Ritornano alla conformazione originale per
  legare
• unaltra molecola di substrato
• Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

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Analisi cinetica del transporto di una molecola
tramite proteina carrier saturazione
In base alla Ia legge di Fick il flusso di
particelle che diffondono liberamente aumenta
linearmente allaumentare della concentrazione
Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata
se si tratta di un flusso di particelle
attraverso la membrana mediato da carriers
I flussi mediati da carriers -a differenza della
diffusione libera - sono saturanti

• Ciò accade per due motivi
• Sulla membrana è presente un numero finito di
  carriers
• Ciascun carrier opera ad una velocità finita

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Rappresentazione del concetto di saturazione con
un esempio numerico
Quesito su cui meditare Distruggendo la metà dei
carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe
inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?
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Come è stato ottenuto il grafico che illustra
come varia il flusso al variare della
concentrazione?
?

1. Si introduce nella provetta substrato S
   radioattivo ad una concentrazione C1
2. A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, ) si preleva
   un campione dalla provetta e si misura la
   concentrazione di S radioattivo allinterno delle
   cellule del campione

1. Normalizzando la velocità v1 rispetto allarea
   della membrana si ottiene il primo valore del
   flusso F1 riferito alla concentrazione C1

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Successivamente si introduce in ciascuna
provetta substrato S radioattivo alle altre
concentrazioni C2, C3, C4 . crescenti e si
ripete la stessa procedura descritta
precedentemente
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I carriers, come gli enzimi, possono essere
soggetti ad inibizione competitiva
Quindi, in presenza di inibitore competitivo il
valore di Fmax non cambia.
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In presenza di Ic varia ka Calcolo della costante
di affinità ka
ka è quel valore di concentrazione del substrato
al quale il flusso è la metà di quello massimo ka
è inversamente proporzionale allaffinità del
carrier per il substrato
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Come funziona un inibitore competitivo?
solo S
S ltlt Ic
S gtgt Ic
Se si vuole costruire un grafico che rappresenti
un range di concentrazioni molto ampio (alcuni
ordini di grandezza) conviene usare una scala
logaritmica
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Quesito del giorno

• Un ricercatore trova che la velocità con cui una
  sostanza è trasportata allinterno di certe
  cellule varia al variare della sua concentrazione
  come illustrato in tabella.
• Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo
  che larea di membrana su cui sono state fatte le
  misure è 310-2 cm2
• Rappresentare graficamente i valori del flusso al
  variare della concentrazione di substrato in due
  grafici distinti ove le concentrazioni sono
  rappresentate rispettivamente in forma lineare e
  logaritmica
• Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka.

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Risposta al quesito
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Esempio di Diffusione facilitata Il Trasportatore
del Glucosio Glucosio Permeasi
extracell.
intracell.
poro formato da 5 a-eliche transmembrana
anfipatiche
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Diffusione Facilitata
soluto
stato B
stato A
esterno
bilayer lipidico
gradiente di concentrazione
interno
sito di legame del soluto
proteina carrier
es. Trasportatore del glucosio negli epatociti La
driving force per il tranporto in qualsivoglia
direzione è determinata dal gradiente di
concentrazione attraverso la membrana
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Attivita' di Ricerca Responsabili Prof. M.
Toselli e Dr. Gerardo Biella   Il LABORATORIO DI
FISIOLOGIA E BIOFISICA DEI CANALI IONICI del
Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia
Cellulari e Molecolari dell'Universita' di Pavia,
diretto dal Prof. Mauro Toselli svolge attivita
di ricerca sui seguenti argomenti l       Canali
ionici voltaggio-dipendenti proprieta'
biofisiche e loro correlazione ad aspetti
funzionali dell'eccitabilita' elettrica nei
neuroni durante lo sviluppo. l       Modulazione
dei canali del calcio e Regolazione del traffico
intracellulare meccanismi molecolari e biofisici
dei processi di regolazione dell'attivita' dei
canali del calcio voltaggio-dipendenti da parte
di protein chinasi e proteine G, e conseguenze
nel controllo della trasmissione, ricezione e
immagazinaggio dell'informazione nei neuroni. l 
Neurofisiologia cellulare Identificazione e
caratterizzazione funzionale dei circuiti
sinaptici delle cortecce paraippocampali. In
particolare ruolo che l'attività ritmica
sincronizzata dei neuroni del sistema limbico
esercita sui processi di apprendimento e
memorizzazione. l       Cellule staminali
neuronali caratterizzazione elettrofisiologica
di cellule staminali neuronali in coltura.   Le
tecniche correntemente impiegate comprendono
misurazioni elettrofisiologiche di patch-clamp
sui seguenti preparati a) linee cellulari
stabili di origine neuronale, wild-type o
opportunamente ingenierizzate per l'espressione
di specifiche proteine ricombinanti normali o
mutagenizzate b) colture primarie di neuroni c)
sezioni sottili di tessuto d) cellule staminali
in coltura.
 Numero di posti disponibili tre posti
disponibili dallinizio del secondo semestre a
dicembre 2005   Requisiti per l'accettazione
verra data la priorita agli studenti che
abbiano superato gli esami di Fisica e Chimica
Generale.
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Alcune considerazioni di bioenergetica
Lenergia è la capacità di compiere un lavoro
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La parte di Energia che il sistema può utilizzare
per compiere un lavoro è definita energia libera
del sistema
Una reazione può essere forzata a procedere in
senso non spontaneo. In questo caso la reazione
assorbe energia cioè occorre compiere un lavoro
sul sistema Una reazione di questo tipo è detta
endoergonica
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Le reazioni chimiche accoppiate
Un processo endoergonico può avvenire se esso
viene opportunamente accoppiato ad un processo
esoergonico
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Consideriamo la seguente reazione endoergonica A
B A-B DGgt0 Affinchè essa possa avvenire
deve attingere energia da una reazione
esoergonica X-P X P Energia DGlt0 La
sequenza di reazioni accoppiate sarà la
seguente A X-P A-P X A-P
B A-B P
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I contenitori di energia nelle cellule
Legami ad alta energia ATP
GTP Gradienti transmembranari Gradienti
ionici a cavallo del plasmalemma Contenitori
intracellulari di Ca2
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Trasporti passivi e attivi a confronto
molecola trasportata
proteina carrier
gradiente di concentraz.
bilayer lipidico
mediata da carrier
diffusione semplice
mediata da canale
trasporto passivo
trasporto attivo
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Trasporti passivi e attivi a confronto

• Il gradiente di concentrazione attraverso la
  membrana determina la direzione e la velocità
  della diffusione passiva.
• Nella diffusione passiva le molecole si muovono
  dalla zona ad alta concentrazione a quella a
  bassa concentrazione (trasporto in discesa)
• Diffusione semplice le molecole diffondono
  attraverso il bilayer lipidico
• Diffusione facilitata diffusione attraverso la
  membrana mediata da proteine di trasporto (non è
  richiesta energia)
• Muovere un soluto in salita (contro il
  gradiente di concentrazione) richiede un ingresso
  di energia - Trasporto Attivo

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Trasporti Attivi
Il trasporto di un soluto contro un gradiente
elettrochimico richiede lutilizzo di energia
Due strategie sono adottate dalle cellule
animali
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Na/K ATPasi
28
Na/K ATPasi
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Na/K ATPasi

• La pompa idrolizza lATP ad ADP per trasportare
  simultaneamente 3 Na dalla cellula e 2 K dentro
  la cellula ad ogni ciclo della pompa
• La Na-K ATPasi è responsabile di gt30 del
  consumo totale di ATP
• Mantiene un gradiente del Na (extgtint) e del K
  (intgtext)
• Contribuisce a creare un potenziale di membrana
  negativo allinterno
• È bloccata dalla ouabaina

Ione Intracellulare Extracellulare Na
5-15 mM 145 mM K 140 mM
5 mM
30
Ciclo della pompa Na/K ATPasi
la proteina subisce un cambiamento
conformazionale, il Na è rilasciato allesterno
fosforilazione ATP-dipendente
ext
int
il Na si lega al sito citosolico
il K si lega al sito extracellulare
la proteina ritorna alla conformazione
originale, il K è rilasciato allinterno
defosforilazione
1 ciclo ? 10 millisecondi
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Alcune importanti caratteristiche della pompa
Velocità di attività dipendente dalla
concentrazione intracellulare di Na
Bloccata dal glicoside cardiaco ouabaina e bassa
ATPi
Stechiometria - 3 Na fuori, 2 K dentro, 1 ATP
usato
Elettrogenica, può generare direttamente da -2 a
-20 mV
Tiene la pressione osmotica sotto controllo,
prevenendo il rigonfiamento cellulare
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Gradiente elettrochimico

• A cavallo della membrana della maggior parte
  delle cellule cè una differenza di potenziale
  elettrico il potenziale di membrana
• Il potenziale di membrana influenza il movimento
  transmembrana di tutte le molecole cariche (ioni)
• Il lato citoplasmatico della membrana plasmatica
  di solito ha un potenziale più negativo rispetto
  allesterno
• La forza elettrostatica spinge i cationi nella
  cellula e guida gli anioni fuori
• Quindi, quando consideriamo la diffusione passiva
  di soluti carichi attraverso una membrana, due
  forze devono essere considerate
• (a) il gradiente di concentrazione transmembrana
• (b) la differenza di potenziale transmembrana
• La driving force netta Gradiente Elettrochimico

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Gradiente Elettrochimico
potenziale di membrana0
potenziale di membrana negativo dentro ?
trasporto dei cationi aumentato
potenziale di membrana positivo dentro ?
trasporto dei cationi ridotto
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Quesito del giorno
In base a quanto detto a lezione, stabilire se la
pompa Na/K, che è elettrogenica dal momento che
trasporta un numero netto di cariche elettriche,
aumenterà o diminuirà la sua velocità dazione
qualora la membrana venga depolarizzata. Ricordars
i che una depolarizzazione comporta un aumento
delle cariche positive allinterno della cellula
rispetto alla situazione di riposo (potenziale di
riposo).
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Alcune definizioni
molecola trasportata
ione co-transportato
ione contro-transportato
Simporto
Antiporto
Uniporto
Trasporti accoppiati
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Altri esempi di trasporti attivi primari
37
Trasporti accoppiati
Il gradiente di un soluto (es. gradiente del Na)
viene usato per guidare in salita il trasporto di
una seconda molecola - trasporto attivo
secondario
Gradiente elettrochimico
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Trasporti accoppiati al gradiente di Na
Nelle cellule animali molti processi di trasporto
di membrana sono accoppiati al gradiente del
Na. Es. Trasporto del glucosio in cellule
dellepitelio intestinale
stato A
stato B
Na
glucosio
ext
gradiente di Na
gradiente di glucosio
carrier
int
Stechiometria 2 Na ? 1 Glc Bloccante florizina
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Altri esempi di trasporti attivi secondari
40
Trasporto del glucosio dal lume intestinale al
sangue
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Quesito del giorno
Una cellula si trova immersa in una soluzione
extracellulare contenente glucosio 10 mM.
Trascorso un certo tempo la concentrazione di
glucosio nel citoplasma sale a 50 mM. Secondo
voi, perche cio prova che la membrana
plasmatica di quella cellula dispone di un
trasportatore attivo del glucosio? Come fareste a
dimostrare sperimentalmente che tale
trasportatore e Na-dipendente (trasporto attivo
secondario)?
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Mantenimento dei livelli di Ca2 intracellulare

• Il Ca2 è coinvolto in molti processi cellulari
• Il mantenimento di bassi livelli di Ca2
  intracellulare è critico for il normale
  funczionamento cellulare
• La Ca2 extracellulare gtgtgtgt della Ca2
  intracellulare
• Le pompe del Ca2 ATP-dipendenti della membrana
  plasmatica e del reticolo endoplasmatico pompano
  attivamente Ca2 fuori dal citoplasma
• Esiste anche uno scambiatore Na/Ca (T.A.II) che
  pompa attivamente Ca2 fuori dalla cellula

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Quali meccanismi mantengono lampio gradiente di
calcio?
ADP
Ca
Pompa del Calcio
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I gradienti di calcio esistono sia allinterno
della cellula che a cavallo della membrana
plasmatica
Ca2
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Concentrazioni ioniche intracellulari ed
extracellulari
Ione Intracellulare Extracellulare Na
5-15 mM 145 mM K 140 mM 5
mM Mg2 0.5 mM 1-2 mM Ca2 10-7 mM
1-2 mM H 10-7.2 M (pH 7.2) 10-7.4 M
(pH 7.4) Cl- 5-15 mM 110 mM Anioni
fissi high 0 mM
La intracellulare è molto diversa dalla
extracellulare I cationi sono bilanciati dagli
anioni
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C\Documents and Settings\Administrator\Documenti\
Didattica\Univ British Columbia Biology 350
Bioenergetics.doc