Le piante transgeniche

1
Le piante transgeniche
2
Trasformazione genetica
Un processo mediante il quale un fenotipo di un
organismo può essere cambiato attraversi
laggiunta di DNA esogeno
Lorganismo così generato è chiamato transgenico
o Genetically Modified Organism (GMO)
3
Utilizzo e valore delle piante transgeniche
Agricoltura

• Miglioramento genetico

• miglioramento delle peformance

Farmaceuticals / Neutraceuticals

• nuove colture per nuovi prodotti

• piante factories o bio-reattori

Ambiente

• riduzione uso pesticidi

• Bioremediation / phytoremediation

4
Modificazione delle piante steps

1. Clonaggio (creazione della cassetta despressione
   del transgene)
2. Trasformazione (via Agrobacterium o altro metodo)
3. Selezione piante trasformate (uso di marcatori
   selettivi)
4. Screening del materiale con appropriata
   espressione genica
5. Isolamento delle linee omozigoti
6. test delle piante ottenute (analisi molecolari e
   despressione genica)

5
Modificazione delle piante clonaggio
Gene reporter/selettivo (es. Green Florescent
Protein o Resistenza ad antibiotici)
Gene dinteresse (es. tolleranza ad erbicidi
o Resistenza a malattie)
Elementi controllo espressione genica (es. solo
in foglia o in seme)
6
Generazione di piante Transgeniche
Agrobacterium tumefaciens
Microiniezione
Biolistico
7
Come vengono prodotte le piante transgeniche
Molto diffusa la trasformazione via Agrobacterium

• Funzione per la maggior parte delle dicotiledoni
  e per alcune moncotiledoni

• non necessita di attrezzature specifiche e può
  essere utilizzato in qualsiasi laboratorio

8
L Agrobacterium un ingegnere naturale

• L Agrobacterium tumefaciens è un batterio del
  suolo che causa la formazione di tumori (crown
  gall) nelle piante

• Contiene il plasmide Ti (Tumor-inducing plasmid)

• Il plasmide Ti possiede una regione di DNA, il
  T-DNA (Transferred-DNA), che viene incorporato
  nel DNA nucleare della painta infettata

9
Ti Plasmid
T-DNA region

• geni vir essenziali per il trasferimento e
  lintegrazione della regione T-DNA

• Auxine iaaM e iaaH sintetizzano gli ormoni
  auxicini della crescita (acido indolacetico)

Cytokinin
Auxin
Opine

• Citochinine - gene tmr (ipt) genera la
  citochinina trans-zeatina. Promuovono la
  crescita cellulare e la formazione delle galle

Left border
Right border

• Opine sono prodotti di reazioni di condensazione
  tra aminoacidi e keto acidi (es. nopaline,
  octopine, agropine). Sintetizzate e secrete
  dalle galle sono utilizzate come fonte di
  carbonio dallAgrobacterium

12-24 kbp
Opine catabolism
vir genes
ori
10
Manipolazione genetica del plasmide Ti

• La delezione dei geni auxinici e delle
  citochinine elimina la formazione delle galle
• Sono stati inseriti dei marcatori selettivi
  batterici di E. coli (selectable shuttle
  vector) al di fuori della regione T-DNA
• Inserimento di marcatori selettivi per pianta
  allinterno della regione T-DNA

• Qualsiasi gene viene inserito allinterno della
  regione T-DNA sarà incorporato nel DNA della
  cellula vegetale (es. geni di resistenza ad
  erbicidi)

• Le cellule vegetali trasformate vengono
  rigenerate come pianta intera attraverso la
  coltura in vitro.

• Ogni cellula della nuova pianta conterrà il
  transgene

11
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a
cellula vegetale
Cellula vegetale
Agrobacterium
T-DNA
Nucleo
Ti plasmid
12
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a
cellula vegetale
Cellula vegetale
ferita
T-DNA
Nucleo
Ti plasmid
Agrobacterium
13
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a
cellula vegetale
Cellula vegetale
Agrobacterium
Segnale di ferita
T-DNA
nucleo
Copia di T-DNA a singolo filamento (protetto da
ssDNA binding protein)
14
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a
cellula vegetale
Cellula vegetale
Agrobacterium
Segnale di ferita
T-DNA
Nucleo
T-DNA
poro
Chromatina
Copia di T-DNA a singolo filamento (protetto da
ssDNA binding protein)
15
Rigenerazione delle piante

• Lagrobatterio viene inoculato sul tessuto
  vegetale
• Il tessuto viene messo in coltura in piastre
  contenenti un antibiotico selettivo
• I calli (tessuti indifferenziati) vengono
  trasferiti in un altro mezzo di coltura contenete
  ormoni di crescita che inducono la formazione di
  germogli e/o radici
• Si può effettuare un controllo dei calli
  trasformati prima della loro rigenerazione
  attraverso unanalisi molecolare (es. PCR)

16
Bombardamento con Microproiettili (biolistico)

• Proiettili sferici di oro o tungsteno (0.4
  1.2?m dia.) vengono ricoperti con il DNA
• Questi proiettili vengono sparati ad alta
  velocità (3-600 metri/sec) mediante
  unapparecchiatura (particle gun) utilizzando
  aria compressa o gas compresso (elio)
• Il proietticle penetra la parete cellulare e le
  membrane (trasformazione d cloroplasti o
  mitocondri)
• Possono essere trasformate un gran numero di
  specie (anche monocotiledoni) che non sono
  suscettibili al trasferimento di DNA via
  Agrobacterium.
• Questo metodo può essere utilizzato anche per
  sospensioni cellulari, colture di calli, tessuti
  meristematici, embrioni immaturi, coleoptili e
  polline.

17
Il transgene RNA Antisenso

• Questa tecnica viene utilizzata normalmente nelle
  piante per bloccare lespressione di geni
  endogeni.

• Frammenti clonati di geni vengono posti nel
  trasgene in orientamento inverso vicino ad un
  promotore.

• Quando questo transgene antisenso viene
  reintrodotto nelle cellule vegetali previene in
  qualche modo la produzione della proteina
  endogena.

• Non si ha un copleto knock-out del gene . Si può
  avere una debole o una maggiore produzione della
  proteina.

18
Alterazione della maturazione dei frutti mediante
RNA Antisenso

• La Poligalatturonase (PG) è un enzima che
  abbassa la pectina nelle pareti dei frutti in
  maturazione

• Le piante transgeniche con PG antisenso (FLAVR
  SAVR tomato) producono poco PG. Le pareti si
  ammorbidiscono molto lentamente

Frutto Wild-type
Attività PG
Frutto PG Antisenso

• Molti geni sono stati manipolati in modo analogo
  per rispordere ad alcune questioni basilari

- qualè il ruolo degli ormoni nella maturazione
dei frutti? - quali enzimi agiscono nella parete
dei frutti ?
0
10
2
4
6
8
Giorni dal primo cambiamento del colore
19
Il transgene RNAi
Una tecnica,che merita particolare attenzione, e
che è stata introdotta solo di recente, è quella
che permette di interferire con lespressione di
alcuni geni dannosi mediante la trasfezione di
piccoli frammenti di RNA a doppio filamento in
grado di antagonizzare lRNA messaggero
corrispondente ( RNA INTERFERENCE).La
tecnologia dellRNAi è basata su un processo di
inattivazione genica post-trascrizionale,
altamente specifico, presente in piante e
animali, innescato da RNA a doppia elica (dsRNA)
omologo alla sequenza del gene da sopprimere.
Diffusamente utilizzato in Caenorhabditis
(nematode) lavora anche in Drosophila, nei
trypanosomi e in pianta
20
RNAi
21
RNAi
22
Il transgene Gene stacking o pyramiding
Utilizzato già nel breeding tradizionale delle
piante (Gene stacking è la combinazione
attraverso lincrocio e la selezione della
pregenie di tratti desiderati in ununica
linea) Biotecnologie nuove strategie di
co-espressione

• Quando è necessario co-esprimere geni multipli
• pathway biochemiche
• enzimi multimerici
• proteine multiple che controllano diversi choke
  points nelle biosintesi

.
23
Miglioramento della tolleranza in pianta di
stress abiotici
clima
Suolo
Temperatura (caldo, freddo)
Disponibilità di nutrienti
Acidità e alcalinità
Idrico (siccità, asfissia)
Stimoli meccanici (vento)
luce
troppa
poca
Inquinanti
Metalli pesanti
Ozono
Applicazione prodotti chimici
erbicidi
24
Erbicidi e problema delle infestanti
10 della perdita di produzione nelle colture è
causata dale malerbe
gt 10 billioni vengono spesi annualmente in
erbicidi
Moltio erbicidi sono attivi contro le colture -
spesso devono essere distribuiti precocemente per
precauzione
Molti erbicidi sono persistenti nel suolo o
lasciano residui tossici
Il tillage (ploughing) può essere utilizzato per
il controlllo delle malerbe ma può prvocare serie
perdite dacqua
25
Modalità dingegnerizzazione per tolleranza ad
erbicidi

• Esistono più di 100 diversi erbicidi con varie
  modalità dazione

• Molti erbicidi agiscono interferendo con enzimi
  chiave

• Molti agiscono a livello di cloroplasti

• Le piante variano nel loro livello di sensibiltà
  agli erbicidi. Alcune sono capaci di

(a) Produrre enzimi che inattivano erbicidi
particolari
(b) Produrre un target alterato di enzimi,
insensibili a particolari erbicidi
(c) Inibire luptake dellerbicida

• Le colture possono essere ingegnerizzate per
  tolleranza aparticolari erbicidi attraverso
  linserimento di singoli nuovi geni

26
La tolleranza ad erbicidi
è il tratto dominante delle colture GM coltivate
a livello commerciale
74 di colture GM coltivate nel 2000 erano
tollaranti ad erbicidi (HT)
7 stacked transgenes (HT Bt gene per
resistenza ad insetti)
delle colture GM globali
coltura
tratto
soia
58
HT
colza
6
HT
mais
5
HT
cotone
5
HT
cotone
4
HTBt
mais
3
HTBt
( 36 della soia coltivata nel mondo è
transgenica)
27
Colture tolleranti al Glyphosate
Le prime colture ingegnerizzate messe in
commercio sono state quelle con tolleranza
allerbicida glyphosate (Roundup)
Attualmente molte colture presentano inserito
questo tratto transgenico (soiia, mais, colza,
cotone ecc)
Colza tollerante
28
Ingegnerizzazione per tolleranza a Glyphosate
Il Glyphosate inibisce un enzima cloroplastico
essenziale nella biosintesi degli aminoacidi
5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic acid
synthase (EPSPS)
Non è stato possibile generare piante tolleranti
al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione
tradizionale
Un mutante del gene EPSPS è stato isolato da
Agrobacterium, che introdotto in pianta
conferisce tolleranza al glyphosate
29
EPSPS Transgene introdotto in pianta
Transit peptide from plant gene added to allow
chloroplast import
Codon usage modified for efficient expression in
plants
promoter
Agro. EPSPS
Regulatory sequences recognised by plant (either
from plant gene or plant virus gene). In this
case 35S CaMV promoter
30
Ingegnerizzazione tolleranza a Phosphinothricina
L-phosphinotricina è un ingrediente attivo negli
erbicidi glufosinate / bialaphos
Questi erbicidi agiscono inibendo la glutamine
synthetase (GS)
- GS necessaria per la sintesi di glutamine da
glutamate e ammonio
- GS previene laccumulo di ammonio a livelli
tossici nelle cellule vegetali
glutamate
L-phosphinotricina
31
Piante tolleranti a Phosphinothricina
Non è stato possibile generare piante tolleranti
al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione
tradizionale
- trasformare piante con un mutante GS
insensibile alla phosphinotricina
- trasformare il gene delle piante per un enzima
che inattiva la phosphinotricina
I geni batterici (pat o bar ) che codificano per
phosphinothricin acetyl transferase sono stati
trasferiti in pianta
detossificano L-phosphinotricina attraverso
acetilazione, così GS non è inibita
Coltivazioni commerciali di Cicoria, rape e mais
tolleranti a Phosphinothricina
32
Tolleranza a Phosphinotricina Introdotta in pianta
Codon usage modified for efficient expression in
plants
polyA
promoter
Bacterial pat
Regulatory sequences recognised by plant (either
from plant gene or plant virus gene). Frequently
use 35S CaMV promoter
33
Tolleranza a stress ambientali
Il progresso per gli stress ambientali attraverso
il breeding classico è andato molto lentamente
Crop
Soyabean
Maize
Wheat
Sorghum
Oat
Abiotic losses ( record yield)
66
82
69
81
75
La tolleranza di solito coinvolge molti geni e
processi fisiologici
Lapproccio transgenico ha dovuto sffrontare
anche questi problemi ma alcuni progressi sonos
stati fatti anche se ancora non ci sono piante in
commercio
34
Risposta della pianta allo stress
Ozono
Riconoscimento stress
Temperature estreme
Stress transduction
asfissia
Alterazione Espressione genica
siccità
Alterazione metabolismo
salinità
Risposte fisiologiche/ sviluppo
35
Risposta della pianta allo stress
Riconoscimento stress
?
? Ca2 Hormones
Stress transduction
Alterazione Espressione genica
Caratteri multigenici
Alterazione metabolismo
Es.

• Antiossidanti prodotti in risposta a molti stress
  per detossificare dai radicali liberi (reactive
  oxygen species -ROS)

• Soluti compatibili (osmo-protectants) sostanze
  osmoprotettive prodotte da alcune piante in
  risposta a stress osmotici come siccità e
  salinità

• heat-shock proteins (HSPs) accumulate in seguito
  a stress da calore

36
Resistenza a siccità/salinità
Trehalosio è un osmoprotettivo contro stress
ambientali congelamento, salinità, caldo e
essiccazione. Il Trehalose (1-?-D-glucopyranosyl
-glucopyranoside) è sintetizzato in due steps nei
lieviti. Zygosaccharomyces rouxii è uno dei
lieviti più osmo-tolleranti, specialmente al
sale. Kwon, S.J., Hwang, E.W. Kwon, H.B.
(2004). Genetic engineering of drought resistant
potato plants by co-introduction of genes
encoding trehalose-6-phosphate synthase and
trehalose-6-phosphate phosphatase of
Zygosaccharomyces rouxii. Korean J. Genet. 26,
199-206. Patate transgeniche mofologicamente
uguali ai parentali
NS ter
NS prom
trehalose-6-P synthase
trehalose-6-P phosphotase
nptII
CaMV 35S
LB
2A
RB
37
Piante transgeniche per resistenza a malattie
38
Impatto delle malattie sulle colture
La colture sono spesso coltivate in modo
estensivo e in monocoltura. Incremento del
rischio di malattie epidemiche
Le malattie limitano in modo significativo la
produttività e richiedono sostanziali apporti di
prodotti chimici.
Crop
Soyabean
Maize
Wheat
Sorghum
Oat
Biotic losses ( average yield)
42
39
41
37
54
Biotic losses include diseases, insects and
weeds
39
Breeding tradizionale

• insetti e funghi sono molto più distruttivi di
  virus e batteri

• In alcuni casi, con il breeding tradizionale si è
  potuto introdurre geni di resistenza da specie
  selvatiche a specie coltivate.

• Per alcune malattie non sono stati trovati geni
  di resistenza efficaci e durevoli

• Riduzione della suscettibilità ai geni di
  resistenza

continua necessità di ricerca fonti di gene di
resistenza
40
Vantaggi delle Transgeniche
Nessuna restrizione legata ad incompatibilità
sessuale
Introduzione di resistenze in specie che in
natura non presentano fonti di resistenze
Colture GM per resistenza ad insetti e virus sono
commercializzate in USA Transgenic insect and
viral resistant crops are already grown
commercially in US e altri Paesi
- mais, cotone, patata, pomodoro resistente ad
insetti
- patata, papaya, zucchini resistenti a virus
41
Resistenza ad insetti
La resistenza ad insetti è il secondo più
importatnte tratto tansgenico nelle colture
commerciali GM
19 delle colture GM per resistenza ad insetti
contengono il gene Bt
Unaltro 7 sono Bt tolleranza ad erbicidi
of global
Crop
Trait
GM crops
15
Bt
Maize
4
Bt HT
Cotton
3
Bt
Cotton
3
Bt HT
Maize
42
Tossine Bt
Le tossine prodotte da Bacillus thuringiensis
uccidono solo gli insetti
Diversi ceppi di Bacillus thuringiensis producono
diverse tossine, ciascuna attuiva solo per uo o
poche specie dinsetti.
Le spore batteriche o isolati della tossina sono
già disponibili come insetticidi organici
43
Tossine Bt
Tossine prodotte nelle spore, e formano cristalli
proteici
Le tossine codificate da geni Cry

• Attività della tossina
• protossina è digerita nellintestino da proteasi
  pH alcalino
• protossina si lega ad un sito specifico sulla
  parete intestinale
• avvengono ulcerazioni e diminuisce lappetito
• si ha la rottura della parete intestinale, larve
  muoiono

44
Colture Bt
Alcune colture (cotone, mais, patata ecc.) sono
state trasformate con diverso geni Cry che
producono tossine attive contro alcuni erbivori.
Ad oggi sono stati utilizzati più di 40 diversi
geni Cry
Codon usage modificato per unefficiente
espressione in pianta
polyA
Bt Cry
promotore
Sequenze regolatrici riconosciute dalla pianta
45
Colture Bt

• Regole di conduzione per minimizzare linsorgenze
  di resistenza a Bt
• 20 mais non-BT (50 cotone non-Bt) in campo
• Monitoraggio

Introduzione di resistenze multiple
incremento dei livelli despressione
impatto con insetti non-target buffer zone
di mais non Bt intorno a mais BT
Transgenic pollen harms monarch larvae". J.E.
Losey et al., Nature 20 May 1999
(correspondence). È stato molto criticato per
dati riferiti ad un solo anno, per uso di larve
molto suscettibili.I lavori attuali riportano
pochi se non effetti nulli, giusta comparazione
con campi trattati con insetticidi
46
Resistenza a Virus
RNA-mediated interference si basa
sullespressione di geni patogeno-derivati o da
frammenti di geni (es. Resistenza patogeno
derivata)
Interferisce con I normali processi patogenici
del microbo sia a livello proteico (resistenza
virale e batterica) sia a livello di RNA ( solo
resistenza virale).
Protein-mediated interference
- espressione di una tossina derivata batterica,
inattivando lenzima per controllare specifici
Pseudomonas
- espressione costitutiva di coat protein
virali (CPs) o proteine di movimento (MPs) per la
protezione di piante a virosi.
Non si conosce bene il meccanismo dinterferenza
mediata dalle proteine.
- necessari livelli di espressione elevati di
coat protein
47
Papaya ringspot virus (PRV)
Questo virus ha avuto un enorme impatto in Hawaii
, con forti riduzioni nella produzione di frutti
freschi
Non esistono in natura geni di resistenza a
questo virus, e senza la produzione di papaya
transgenica la produzione industriale nelle
Hawaii potrebbe essere distrutta.
Dal 1996 nelle hawaii si coltiva papaya PRV
resistente.
48
Resistenza a PRV in Papaya
Il gene della coat protein di viene espresso
mediante il promotore 35S CaMV. La papaya è stata
trasformata attraverso metodo biolistico.
promoter
polyA
PRV coat protein gene
Regulatory sequences recognised by plant (either
from plant gene or plant virus gene). In this
case 35S CaMV promoter and terminator
Questo gene conferisce resistenza parziale a PRV
in una varietà (Rainbow) e resistenza completa
in unaltra (SunUp)
Gli agricoltori gestiscono la coltivazione con
molta cura per minimizzare la pressione di
selezione sui virus per il mantenimento della
resistenza.
49
Would it surprise you to know that saving a crop
from a virus helped save a community from
disaster? Through advancements in plant
biotechnology, researchers developed a type of
papaya that is resistant to a virus that was
destroying Hawaiis crops. This healthier plant
not only kept Hawaiian farming communities in
business, it also resulted in an increase in
papaya production. And its just one example of
how crops enhanced by plant bio- technology
could one day help feed an ever-increasing world
population. The research is on- going and the
facts are there to be examined. If you want to
learn more we invite you to call us or visit our
web site www.whybiotech.com
Council for Biotechnology Information
50
Resistenza multipla a virus in zucchini
Geni Coat protein per 3 virosi (cucumber
mosaic virus CMV zucchini yellow mosaic virus
ZYMV watermelon mosaic virus 2 WMV 2) sono stati
introdotti in Cucurbita pepo
- tutti espressi dal promotore 35S CaMV
CMV CP
WMV 2 CP
ZYMV CP
LB
RB
t
t
t
Prom
nptII
Prom
Prom
Prom promoter t terminator
protegge contro I 3 virus
51
Resistenza a virus in pianta
Transcapsidazione

• Se la pianta viene infettata da unaltro virus
  questo potrebbe essere incorporato nel capside
  codificato dal transgene provocando un
  mascheramento virale.
• La coat protein introdotta sarà sufficiente a
  produre il mascheramento?
• Se ciò si verifica si possono avere nuove
  proprietà biologiche?

Sinergia
Se la pianta viene infettatabda unaltro virus,
si possono avere manifestazioni di sintomi più
gravi a causa della presenza della coat protein?
Ricombinazione
La frequenza del fenomeno potrebbe ssere
incrementata? Si possono avere nuovi
ricombinanti?
52
Quale futuro?
53
Miglioramento del valore nutrizionale degli
alimenti
54
Modificazioni nutrizionali
Miglioramento del contenuto proteico e
qualitativo
Incremento delle vitamine, antiossidanti, ferro e
altri minerali ecc.
Rimozione dei fattori antinutrizionali quali
inibitori delle proteasi e lecitine. Remove
anti-nutritional factors e.g. protease
inhibitors, lectins
Modificazione del contenuto in grassi saturi.
Incremento/decremento di fenoli e fibre
55
Miglioramento qualitativo delle proteine
Animali and uomini devono incorporare 10
aminoacidi essenziali attraverso il regime
alimentare in quanto incapaci di produrli da se.
Il valore nutrizionale delle proeine di riserva
delle sementi risulta spesso limitato.
posssono deficitare di uno o più aminoacidi
essenziali per la salute umana (es. Nei legumi
perdita di cisteina e metionina)
Il bilanciamento aminoacidico nelle sementi è
stato manipolato in laboratorio mediante diverse
strategie
- introduzione di proteine di riserva nei semi da
altre specie
- alterazione in vitro delle sequenze dei geni
delle proteine di riserva
- manipolazione della pathway della biosintesi
degli amino acidi per incrementarne alcuni
Strategie simili sono state utilizzate per
migliorare il contenuto e la composizione
proteica in colture no-food
56
Increased nutritive value of transgenic potato
by expressing a nonallergenic seed albumin gene
from Amaranthus hypochondriacus Chakraborty et
al., PNAS 97, 3724-3729 (2000)
La patata, la quarta coltura nel mondo, è
utilizzata per produrre alimenti, mangimi, amido
e alcool.
Limitata in lisina, tirosina, metionina e
cisteina
Patate trasformate con gene di Amaranthus
hypochondriacus che codifica per la produzione di
albumina nei semi presentano un buon
bilanciamento aminoacidico
p35S CaMV
2 costrutti alternativi. Promotore constitutivo o
tubero-specifico
pSB8
AmA1
Nos 3
Nos 3
AmA1
pSB8G
pGBSS
lespressionei nei tuberi è da 5 a 10 volte
maggiore quando si utilizza il promotore GBSS
promoter piuttosto chi il 35S
57
Cambiamenti qualitativi proteici nelle patate
transgeniche
contenuto in aminoacidi essenziali da 3 a 5
volte più elevato
Contenuto proteico totale incrementato del 35-45
8-
Fold increase
4-
1-
D E S G H R T A P Y V M C I L F
K
Amino acid
Le piante producono il doppio rispetto al
wild-type
Lalbunia di Amaranthus non è allergenica
- già utilizzata come farina in Messico e Sud
America
- test iperallergenici condotti su animali come
mangime non evidenziano reazioni allergiche
58
Vitamina A
La vitamina A (retinolo) è essenziale alla
crescita umana.
Il nostro corpo non produce vitamina A, e la
possiamo incamerare dalla dieta per due vie
- 50 come pro-Vitamina A dei carotenoidi delle
piante che viene convertita il vitamina A
nellintestino.
- ingestione diretta da alimenti animnali e
supplementi.
Tutti I carotenoidi che contendono anelli ?
possono essere convertiti in retinolo, e una
delle più importanti pro-vitamine dei carotenoidi
è il ?-carotene
59
Deficenza in vitamina A
400 milioni di persone sono a rischio per
deficienza in vitamin A (VAD), in particolare in
Asia e Africa.
circa 2.5 milioni delle morti annue riguardano
bambini sotto i 5 anni
VAD rende I bambini particolarmente suscettibili
ad infezioni.
0.5 milioni di bambini diventano cieci a causa
della VAD
Il ricorso a supplementi in vitamina A è riuscito
a ridurre I problemi del 50 nelle aree soggette,
ma ciò risulta molto oneroso e non utilizzabile
in tutte le aree.
60
Pro-vitamina A in pianta
?-carotene è un pigmento richiesto nella
fotosintesi
- prodotto in tutti I tessuti verdi della pianta
- prodotto anche nellendosperma del mais giallo
e del sorgo
Il riso è una coltura fondamentale per la gran
parte del modo ma la granella di riso non produce
vitamina A o il suo precursore, ?-carotene
La VAD è un problema molto serio nelle regioni in
cui il riso è la derrata alimentare principale
più del 70 di bambini sotto I 5 anni ne sono
affetti
La ricerca di mutanti di riso con ?-carotene
neklla granella è stata un insuccesso.
- alcune varietà di riso non lucido unpolished
rice (riso bruno e riso rosso) possono produre
vitamina A ma la gran parte di riso è lucido con
laleurone rimosso prima che diventi rancido
allimmagazzinamento.
61
Produzione del Golden Rice
Il progetto riguardante lintroduzione della
pro-vitamina A è durato 8 anni
Ingo Potrykus and Peter Beyer con fondi dell
Rockefeller Foundation e EU
inizialmente è stato mostrato che lultimo
precursore della pathway dei carotenoidi
nellendopserma del riso è il geranylgeranyl
pyrophosphate (GGPP)
Può arrichire in ?-carotene via 4 enzimi
phytoene synthase, phytoene desaturase,
?-carotene desaturase, lycopene cyclase
Questi geni sono stati isolati da narciso ed
introdotti in riso ad uno ad uno.
62
Produzione del Golden Rice
Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP)
Phytoene
? -carotene
Lycopene
ß-carotene
63
Produzione del Golden Rice
Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP)
1 esper.mostrava che riso transgenico
espirmente PS di narciso era normale, fertile and
produceva phytoene
Phytoene synthase
Phytoene
Phytoene desaturase
Erwinia uredovora double desaturase crtI
? -carotene
? -carotoene desaturase

• Si può deviare la pathway verso il b-carotene
• (2) Incanalare la GGPP via da altre pathways
  nion ha effetti dannosi

Lycopene
lycopene ß-cyclase
ß-carotene
Daffodil
Erwinia
64
Engineering provitamin A (ß -carotene)
biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice
endosperm. Ye et al., Science 287,303-305
(2000).
Due T-DNAs codificanti per 3 geni della
pro-vitamin A (più il gene marcatore selettivo)
sono stati introdotti insieme via Agrobacterium
attraverso co-transformation
Daffodil 1 phytoene synthase Daffodil 2
lycopene ß-cyclase Erwinia Erwinia double
desaturase - with added transit peptide,
expressed from 35SCaMV
promoter
With own native transit peptides and
endosperm-specific promoter from rice glutelin
(GT1 promoter)
La granella del riso transgenico mostrava un
colore giallo oro brillante. La migliore linea
aveva l85 di carotenoidi come ß-carotene
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Produzione del Golden Rice
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Produzione del Golden Rice
Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells,
R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y.,
Hinchliffe, E., Adams, J.L., Silverstone, A.L.
Drake, R. (2005).Improving the nutritional value
of Golden Rice through increased pro-vitamin A
content Nature Biotechnology 23482-487.
In molte pathways biosintetiche multi steps
esistone degli steps limitanti. Il collo di
bottiglia in questo caso era rappresentato dalla
attività enzimatica di PSY (gene codificante per
la phytoene synthase) .
Dopo aver provato diversi gei PSY provenienti da
diverse fonti è stato provato che la combinazione
gne del mais e del riso davano la migliore
combinazione
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Produzione del Golden Rice
Golden Rice2 che è stato ottenuto accumulava 37
µg/g di carotenoidi di cui 31 µg/g ß-carotene
circa 23 volte quello del Golden Rice precedente.
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Alimenti funzionali
Altre definizioni

• Alimenti supplementati con ingredienti che
  conferiscono benefici alla salute.
• Alimenti che producono effeti benefici al corpo
  mediante adeguata nutrizione.

Esisteno diversi lavori in corso che utilizzano
Gm per generare alimenti funzionali quali ad
esempio incremento degli antiossidanti, delle
vitamine, dei fenoli e delle fibre.
Per esempio
La supplementazione della dieta con
carotenoidi,lycopene e ß-carotene, reduce le
malattie al cuore, alcuni tumori ecc.
I pomodori sono la principale fonte di lycopene
nella dieta e hanno anche un buon contenuto in
ß-carotene
Lo stesso gene phytoene desaturase (crtI) di
Erwinia che è stato utilizzato nel golden
rice è stato introdotto in pomodoro per
aumentare il ß-carotene
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Neutraceuticals
Ralley, L., Enfissi, E.M.A., Misawa, N., Schuch,
W., Bramley, P.M. Fraser, P.D. (2004).
Metabolic engineering of ketocarotenoid formation
in higher plants. Plant J. 39 477-486
Astaxanthin, canthaxanthin, and zeaxanthin sono
carotenoidi ad alto valore utilizzati
nellìindustria come coloranti o supplementi
alimentari. Hanno anche un elevato potere
antiossidante ed è stato riportato che portano
benefici alla salute attraverso unazione
immunologica e prevevendo la formazione dei
tumori.
Sono state generate piante transgeniche
esprimenti I geni del carotenoide 4,4 oxygenase
(crtW) e 3,3 hydroxylase (crtZ) di Paracoccus,
simultanemente
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Vaccini
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Cosa sono i vaccini edibili?
Un vaccine edibile è una proteina geneticamente
ingegnerizzata da un materiale edibile che, una
volta alterata geneticamente, viene inserita nel
materiale, Ingerita oralmente porta una
produzione naturale di anticorpi contro una
specifica proteina virale, proprio come gli altri
vaccini
I vaccini edibili differiscono da quelli
tradizionali nel modo in cui essi stimolano la
produzione di anticorpi nel ricevente che, nel
caso dei vaccini edibili avviene durante la
digestione
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Vaccini
La proteina antigene dovrebbe interagire con la
mucosa del tratto gastrointestinale , attivando
le cosidette mucous type of immune protection.
Come risultato lorganismo dovrebbe sintetizzare
gli anticorpi contro la proteina virale. Quindi
la proteina antigene è liniziatore che stimola
il corpo a produrre anticorpi necerrari ad una
efficace vaccinazione.
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(No Transcript)
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Oral immunization of mice with transgenic tomato
fruit expressing respiratory syncytial virus-F
protein induces a systemic immune response
Jagdeep S. Sandhu1, Sergei F. Krasnyanski2,
Leslie L. Domier3, Schuyler S. Korban2, Mark
D.Osadjan1 Dennis E. Buetow1
Transgenic Research 9 127135, 2000.
Respiratory syncytial virus (RSV)
fruit-based edible subunit vaccine against RSV
was developed by expressing the RSV fusion (F)
protein gene in transgenic tomato plants.
preferentially fruit-expressed E8 promoter
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Biotech Farm
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Biotech Farm
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Biotech Farm
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Biotech Farm