Inmunofluorescencia y Enzimoinmunoanlisis

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Inmunofluorescencia y Enzimoinmunoanálisis
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• El uso de anticuerpos con derivados fluorescentes
  para la detección de trazas de antígenos fue
  introducido por Coons en el año 1941. Mostró que
  los Acs podían ser copulados a beta-antraceno,
  manteniendo intacta la capacidad de unión Ag-Ac,
  mientras que el Ac fluorescente aumentaba
  enormemente la detectabilidad del Ag. Años más
  tarde (1958) Riggs y col. introdujeron un
  compuesto fluorescente mucho más estable, el
  isotiocianato de fluoresceína (FITC), que ha
  quedado hasta la fecha, como el fluorocrmo más
  usado.
• Una de las desventajas del FITC es que pierde
  rapidamente fluorescencia cuando es sometido a
  una intensa iluminación.

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• Principios de la Inmunofluorescencia.
• Cuando la luz es absorbida por ciertas moléculas
  denominadas fluorocromos, la energía de los
  fotones puede ser transferida a electrones, que
  asumen un nivel de energía mayor. Cuando el
  electrón retorna a su estado de energía
  vibracional original (nivel de energía menor del
  estado exitado) algo de la energía se libera
  dentro de los 10-15 seg. como energía calórica.
  La energía remanente se libera luego de pocos
  nanosegundos como un fotón de menor energía que
  el fotón inicial. Este fenómeno se conoce como
  fluorescencia y la eficiencia se describe con el
  término de rendimiento cuántico.
• Las longitudes de onda que son capaces de que
  una molécula fluoresca se llaman espectro de
  exitación y las longitudes de onda donde se emite
  la fluorescencia se llaman esprectro de emisión.
  El espectro de emisión es ligeramente desplazado
  a una longitud de onda superior que el espectro
  de exitación.
• La intensidad de la fluorescencia depende de las
  características fisícas del medio. Algunos
  fluorocromos son más fluorescentes en medio
  acuoso (ej. FITC), mientras que otros lo son en
  medios no polares (ej.dimetilamino naftaleno). El
  espectro característico de la fluorescencia
  también depende del pH.

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• Elección del Fluorocromo
• La elección de un fluorocromo dependerá de una
  serie de factores. Si se necesita un único color
  el fluorocromo de elección será el FITC. El FITC
  es barato, tiene un alto rendimiento cuántico y
  es relativamente hidrofílico. La rápida pérdida
  de la fluorescencia bajo una intensa iluminación
  ultravioleta puede ser solucionado por el añadido
  al preparado de fenilen diamina o n-propil
  galato, sin embargo estos reactivos son tóxicos
  para células vivas. El derivado triazínico de la
  fluoresceína, el dicloro-triazinilamino
  fluoresceína (DTAF) posee propiedades ópticas muy
  similares al FITC pero es mucho más estable.
• El segundo fluorocromo más popular es el
  isotiocianato tetrametil de rodamina (TRITC), que
  es mucho más fluorescente que el isotiocianato de
  rodamina. La intensa fluorescencia roja del TRITC
  es fácilmente distinguible de la verde del FITC.
  Debido a ello por varios años fueros los dos
  fluorocromos de elección para experimentos con
  fluorescencia combinada. La pérdida de la
  fluorescencia del TRITC es mucho menor que la
  FITC.

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(No Transcript)
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• El fluorocromo TRITC es más hidrofóbico que el
  FITC, por lo tanto tiende a unirse
  inespecificamente a proteínas y células. Su
  naturaleza hidrofófica también puede causar
  desnaturalización de los anticuerpos si están
  altamente marcados. Algunos de estos problemas
  debidos a la poca solubilidad del TRITC han sido
  solucionados por el nuevo fluorocromo, el
  isotiocianato de morfolin rodamina (MRITC), que
  es más hidrofílico y posee propiedades ópticas
  similares.
• La excesiva conjugación de anticuerpos con TRITC
  y sus derivados, también puede causar una severa
  reducción de la intensidad de la fluorescencia
  debido al auto-quenching. El TRITC ha sido usado
  para fluorescencia de dos colores con la
  fluorescence-activated cell sorter (FACS), pero
  pero su sensibilidad es relativa debido a la poca
  exitación del laser de argón que se utiliza (488
  y 514 nm). A pesar de todos los inconvenientes
  arriba indicados el TRITC es un muy útil
  fluorocromo. En los últimos años han sido
  sintetizados dos nuevos derivados de rodamina
  XRITC y Texas red, que es un sulfonil cloruro
  derivado. Sus espectros de absorción y emisión
  son muy semejantes. Los productos de hidrolisis
  del Texas red son muy solubles en H2O, por lo
  tanto son fácilmente eliminados y sin riesgo de
  adsorción inespecífica a proteínas. En el caso
  del XRITC ocurre lo contrario, ya que sus
  productos de hidrólisis son altamente
  hidrofóbicos.

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• Las ficobiliproteínas o ficoeritrinas, proteínas
  derivadas de algas rojas son consideradas como un
  potencial importante debido a su extremadamente
  alto coeficiente de absorción molar y rendimiento
  cuántico. Esto se debe a la presencia de
  múltiples cromóferos. La R-ficoritrina es
  considerada el cromófero ideal para FACS, ya que
  su esprectro de exitación se halla cercano a la
  logitud de onda del laser por argón (488 nm). El
  espectro de emisión comienza a 550 nm y el pico
  es a 580 nm, pudiendóse considerar por tal motivo
  como el cromógeno ideal para combinarlo con el
  FITC. Las ficoeritrinas son altamente solubles y
  estables y son facilmente purificadas.
• Los métodos de copulación de las ficoeritrinas a
  Acs utilizan ficoeritrina biotinilada, unida a
  avidina y purificando el conjugado por HPLC.
  Algunos sitios de unión de la biotina quedan
  libres para la unión del Ac. Alternativamente las
  ficoeritrinas pueden ser copuladas a Acs vía
  puentes di-sulfuro.

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• Fluroscence-activated Cell Sorter (FACS)
• El desarrollo del FACS ha sido un gran aporte
  para la Inmunofluorescencia y en general para la
  Biología celular. El FACS también se conoce como
  citometría de flujo. Los principios operativos,
  brevemente son a una suspensión celular se le
  añade un anticuerpo marcado con un fluorocromo se
  la hace pasar a través de un estrecho túnel que
  incide luz emita por rayo laser la fluorescencia
  emitida es colectada por un sistema óptico con un
  ángulo recto de iluminación. La fluorescencia
  emitida por cada tipo de células es colectado en
  la memoria de una computadora. La mayoría de
  estas máquinas son capaces de separar diferentes
  tipos de células. El FACS puede analizar hasta
  5000 células/seg y permite combinar diferentes
  parámetros a diferencia del microscopio de
  fluorescencia es mucho más rápido y objetivo. La
  elección del fluorocromo depende de la longitud
  de onda de emisión del rayo laser. El más usado
  es el laser de argón que tiene un fuerte haz a
  488 nm que es conveniente para FITC, pero no para
  TRITC. La ficoeritrina es eficientemente excitada
  a 488 nm por lo tanto puede ser usada en
  combinación con FITC.

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Condiciones de marcación de Acs. Con diferentes
fluorocromos
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Estructura de diferentes fluorocromos
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Espectro de excitación y emisión de anticuerpos
secundarios marcados con diferentes derivados de
rodamina

• Tetrametil rodamina-isoticianato (TRITC). Lab.
  Jackson
• Lisamina-rodamina sulfonil cloruro (LRSC)
• Texas Red sulfonil cloruro (TRSC)

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Estructura cristalográfica de GFP
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Espectro de emisión y excitación de GFP

• Espectros de excitación y emisión (líneas
  sólidas y punteadas respectivamente) de miembros
  típicos de mutantes de GFP.

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ENZIMOINMUNOANALISIS

• Los Enzimoinmunoanálisis (EIA) son técnicas
  altamente sensibles que se utilizan para la
  detección de Ags. y Acs.
• El reactivo se conjuga con una enzima

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• Ventajas y desventajas de los métodos que usan
  enzimas comparados con los métodos que usan Acs
  fluorescentes
• Ventajas
• -Puede ser usada microscopía de luz visible.
• -La estructura celular puede ser facilmente
  apreciada.
• -Puede ser usada a niveles ultraestructurales.
• -Los preparados son mucho más duraderos
• -La detectabilidad con ciertos procedimientos es
  significativamente mayor
• -Mayor vida media de los reactivos.

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• Desventajas
• -Más laboriosa la preparación de los conjugados.
• -Algunos sustratos son carcinogénicos.
• -El ensayo puede ser más laborioso.
• La baja penetración del anticuerpo dentro de la
  membrana celular puede constituir un obstáculo
  para la detección de antígenos intracelulares, en
  especial en microscopía elctrónica. El incremento
  de la permeabilidad puede o no ser factible en
  algunas técnicas
• (i) puede interferir con la inmunoreactividad de
  los epitopes antigénicos
• (ii) puede solubilizar el Ag y redistribuirlo y
• (iii) puede cambiar la morfología del tejido. Las
  condiciones óptimas para los últimos dos
  requerimientos es necesario una rápida y completa
  fijación, mientras que para la presevación de la
  inmunoreactividad requiere un menor grado de
  fijación.

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CLASIFICACION

• Los EIA pueden ser clasificados de acuerdo a los
  siguientes criterios
• 1- Qué reactivo se quiere determinar, por ejemplo
  Ac o Ag.
• 2- Qué reactivo es marcado
• 3- Si son usados métodos competitivos o
  no-competitivos.
• 4- Qué método de separación del reactivo libre y
  unido se utiliza.
• Existen dos tipos principales de EIA homogéneos
  y heterogéneos. En los sistemas heterogéneos, la
  reacción Ag-Ac no afecta a la actividad
  enzimática. En los homogéneos, la interacción
  Ac-Ag modula la actividad de la enzima. La
  modulación de la actividad enzimática elimina la
  necesidad del paso de separación o inactivación
  de la enzima. El término de ELISA fue usado por
  primera vez por Engvall y Perlmann en 1971. Los
  ELISA pueden ser desarrollados con diferentes
  configuraciones, pero, siempre uno de los
  reactantes debe estar inmobilizado en una fase
  sólida.

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Ventajas y desventajas de los EIA

• Ventajas
• -Ensayos muy sensibles que pueden ser
  desarrollados por el efecto amplificante de la
  enzima usada.
• -Los reactivos son relativamente baratos y pueden
  tener una prolongada vida media
• -Pueden desarrollarse simultaneamente múltiples
  ensayos.
• -Pueden desarrollarse una gran variedad de
  modificaciones
• -El equipamiento no es costoso
• -No se utilizan reactivos radiactivos
• -Los EIA son rápidos y simples y pueden ser
  fácilmente automatizados
• -Los EIA homogéneos pueden aplicarse a haptenos y
  proteínas

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• Desventajas
• -La medición de la actividad enzimática puede
  ser, en algunos casos más compleja que la
  medición de algunos radioisótopos.
• -La actividad enzimática puede ser afectada por
  algunos constituyentes plasmáticos.
• -Algunos ensayos homogeneos no son tan sensibles
  como los RIA.
• - Se han desarrollado EIA homogéneos para
  proteínas pero requieren reactivos complejos.

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Tipos de EIA homogéneos

• 1- El analito (antígeno) está conjugado con la
  enzima
• 2- El sustrato enzimático es fluorescente luego
  de la reacción
• 3-Se utiliza un cofactor
• 4-Anticuerpo conjugado
• 5-Modulador enzimático

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• EIA HOMOGENEOS
• Los Enzimo inmunoanálisis homogéneos (EIAH) se
  definen como un sistema de inmuno análisis en que
  el Ag y Ac y la reacción se realiza en solución
  sin necesidad de separar el Ac libre y unido. Los
  EIA homogéneos son necesariamente competitivos y
  pueden definirse por la siguiente ecuación
• Ag Ag Ac Ag Ac Ag Ac
• La sensibilidad de los EIAs homogéneos dependen
  de los cambios de señal a ser medidos, que pueden
  ocurrir durante o después de la inmunoreacción
  por
• 1-Alta afinidad del Ac.
• 2-Bajo peso molecular del analito
• 3-Formación de grandes complejos inmunes
• 4-Sustratos de alto peso molecular.
• Los haptenos de bajo tamaño actúan como analitos
  entre el Ac. y la enzima.

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• Los EIA se pueden dividir en
• ensayos tipo I (competitivos) y
• tipo II (no-competitivos), dependiendo del
  principio de la reacción usado. Solo los de tipo
  I se usan en rutina para analitos de bajo peso
  molecular.

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Tipos de EIA homogéneos

• 1- El analito (antígeno) está conjugado con la
  enzima
• 2- El sustrato enzimático es fluorescente luego
  de la reacción
• 3-Se utiliza un cofactor
• 4-Anticuerpo conjugado
• 5-Modulador enzimático

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• Los EIA homogéneos son ensayos en los cuales la
  medición se realiza sin la separación de los
  componentes "libres "y "unidos". Se basan en
  cambio de la actividad enzimática luego de la
  unión Ac-Ag. A pesar que pueden requerir
  reactivos complejos, se realizan fácilmente por
  simple mezcla de los reactivos y medición de la
  actividad enzimática remanente, que correlaciona
  la concentración del analito.
• Los EIA homogéneos han sido diseñados para la
  detección de hormonas y drogas. En general estos
  ensayos son menos sensibles que los heterogéneos,
  ya que la sensibilidad de éstos ha sido igualada
  a los RIA.
• La mayoría de los EIA homogéneos son rápidos y
  sencillos de realizar y se adaptan muy bien a la
  automatización. Inicialmente fueron diseñados
  para la detección de moléculas de bajo peso
  molecular como ser hormonas y drogas. En la
  actualidad también se utilizan para moléculas más
  complejas como proteínas.

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Selección de la enzima

• Son muy importantes los criterios de selección de
  una enzima particular
• 1-Turnover, el número de moléculas de
  sustrato-enzima.
• 2-Pureza
• 3-Sensibilidad
• 4-Facilidad y rapidez para su detección
• 5-Ausencia de factores que interfieran en la
  reacción
• 6-Grupos reactivos potenciales
• 7-Estabilidad
• Idealmente, las enzimas deben tener un alto
  turnover y un sustrato que produzca un producto
  estable y fácilmente medible. Las enzimas deben
  ser estables y disponible en grandes cantidades
  en una forma pura y debe ser fácilmente conjugada
  a diferentes haptenos o proteínas.

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Las siguientes enzimas son las más comúnmente
usadas

• Para EIA heterogéneos
• 1-Horse radish peroxidasa
• 2-Fosfatasa alcalina
• 3- beta-galactosidasa
• 4-Glucosa oxidasa
• 5-Glucoamilasa
• 6-Anidrasa carbónica
• 7-Acetilcoliesterasa

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• Para EIA homogéneos
• 1- Lisozima
• 2- Malato dehidrogenasa
• 3- Glucosa 6-Fosfato dehidrogensa
• 4- Ribonucleasa A
• 5- Galactosidasa

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Tipos de EIA homogéneos1-Ensayo con analito o
antígeno conjugado (EMIT)

• Una enzima es covalentemente unida al analito y
  el Ac anti-analito modula la actividad de la
  enzima. Se ha desarrollado comercialmente este
  EIA con el nombre de EMIT (enzyme multiplied
  immnuassay technique), para la detección de
  drogas antiepilépticas, drogas cardioactivas,
  drogas antiasmáticas, drogas anti-neoplásicas y
  de abuso.
• La competición se produce entre el Ag no marcado
  (analito de la muestra) y el Ag por una cantidad
  limitante de Ac.
• Los primeros EIAH se desarrollaron copulando una
  enzima al analito de bajo peso molecular (Ag)
  que se desea analizar en una muestra (Ag). Este
  ensayo se conoce como técnica de múltiple
  enzimoinmuno análisis (enzime-multipeid
  immunoassay technique EMIT). Fig 1. En este tipo
  de ensayo, la unión del ligando-enzima al Ac
  produce un cambio en la actividad enzimática, por
  impedimento estérico causado por la unión del
  ligando al Ac. De esta manera el sitio activo de
  la enzima no puede interaccionar con su sustrato
  específico. La dosis respuesta es máxima cuando
  todo el ligando copulado a la enzima se halla al
  estdo libre. El límite de detección para haptenos
  se halla en el orden de 10-9 mol/l.

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• Un ejemplo de este ensayo es la cuantificación de
  tiroxina T4 y la enzima utilizada es la maleato
  dehidrogenasa.
• La presencia del anticuerpo, la actividad
  enzimática es proporcional a la cantidad de
  analito libre. Las enzimas más utilizadas en este
  ensayo son la maleato dehidrogenasa y la
  6-fosfato dehidrogenasa, ya que son poco
  afectadas por los constituyentes del suero y
  además tienen un alto turnover. También se usan
  lisozima y -galactosidasa.
• La sensibilidad del EMIT está determinada por
  1-el límite de detección de la enzima conjugada,
  2- por el cambio en la actividad de la enzima
  conjugada luego de la unión al Ac, 3- por la
  constante de afinidad del Ac en la reacción y 4-
  por la presencia de alguna sustancia que pueda
  interfierir en la actividad de la enzima como ser
  inhibidores, enzimas endógenas, etc.

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(No Transcript)
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2-El sustrato enzimático es fluorescente luego de
la reacción (SLFIA)

• El ensayo se denomina inmunoensayo por
  copulación de un sustrato fluorescente
  (sustrate-labeled fluorescence immnoassay). En
  este caso el hapteno es marcado con un sustrato
  fluorogénico, como ser beta-galactosil
  umbeliferona. Este sustrato, al estado nativo no
  es fluorescente, pero cuando es hidrolizado por
  la beta-galactosidasa, libera la umbeliferona,
  que es fluorescente. Por lo tanto en ausencia de
  analito en la muestra, el sustrato-hapteno es
  unido al Ac y por impedimento estérico la enzima
  no puede acceder al sustrato. El límite de
  detección de este ensayo es menor, comparado con
  otros EIAH, ya depende de la fluorescencia
  liberada. El límite de detección es del órden de
  10-6 mol/l. Este esquema se aplica para la
  medición de haptenos, usando sustratos
  quimioluminiscentes, de este modo se aumenta
  enormemente la sensibilidad. Se aplica en ensayos
  para la medición de drogas anticonvulsivantes. Un
  típico ensayo SLFIA puede ser para valorar
  gentamicina. La gentamicina se copula a
  beta-galactosil umbeliferona, que forma un
  sustrato no fluorescente, que reaccionará con la
  -galactosidasa para formar un producto
  fluorescente. Sin embargo si está presente el Ac.
  anti-gentamina, por impedimento estérico la
  enzima no actuará. La producción de fluorescencia
  será proporcional a la cantidad gentamicina en la
  muestra. Este ensayo es posible de realizarse en
  pocos minutos y su sensibilidad es comparada al
  RIA.

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• 3-PGLIA. Este ensayo se denomina Inmunoensayo por
  copulación de un grupo prostético (prosthetic
  group-labeled immunoassay), y también se conoce
  como ARIA (apoenzyme reactivation immunoassay).
  Se basa en la activación de la enzima, glucosa
  oxidasa por su grupo prostético FAD. El hapteno
  copulado con el grupo prostético compite por el
  Ac, con el hapteno de la muestra. El remanente
  grupo prostético se combinará con la apoenzima
  produciendo su reactivación.
• La glucosa oxidasa es una excelente enzima para
  este tipo de ensayos, ya que la apoenzima es
  completamente inactiva y estable. El límite de
  detección es del orden de 10-8 -10-9 mol/l. Se
  utiliza generalmente para la detección de drogas.

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• 4-Inmunoensayo por copulación a un cofactor
  (CLIA). (cofactor-labeled homogeneous
  immunoassay)
• Es similar al ARIA. En este caso (Fig. 4). En
  este caso el hapteno-cofactor participa en una
  reacción cíclica enzimática. Como en el ARIA, la
  señal medida es directamente proporcional a la
  concentración de hapteno en la muestra. Debido a
  la utilización de dos enzimas, este ensayo
  teóricamente tiene un alto límite de detección,
  sin embargo, en el suero existen cantidades
  variables de NAD, por la tanto esto limita las
  cantidades de suero a utilizarse en el ensayo.
• 5-ILIA. El uso de un inhibidor enzimático
  copulado al hapteno (inhibitor-labeled immuno
  assay), también ha sido usado en EIAH. La
  modulación de la actividad enzimática es
  dependiente de un inhibidor unido al hapteno. El
  límite de detección de este ensayo está en el
  órden de los 10-7 - 10-8 mol/l. (Fig. 5)

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• 6-CEDIA. El enzimo inmunoanálisis por clonado del
  dador (cloned enzyme donor immunoassay) es una
  metodología nueva, que usa los principios de la
  tecnología recombinante. Se basa en la generación
  de dos fragmentos de la enzima beta-galactosidasa,
  que separados no poseen actividad. Cuando se
  unen, la enzima recupera la actividad. Este
  proceso se llama complementación. Uno de los
  fragmentos, llamado dador se une al hapteno (ED),
  y es un pequeño péptido de 70-90 aa. El segundo
  fragmento contiene el 97 del total de la enzima
  y se llama fragmento aceptor (EA). Este ensayo es
  uno de los EIAH más sensibles que se hallan en el
  comercio, con un límite de detección que oscila
  en el orden de 10-11 mol/l.

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Principio de EIA CEDIA
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Estructura de análogos de metanfetamina
sintetizados y que fueron capaces de inducir
anticuerpos monoclonales específicos y de alta
afinidad