Microscop

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Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular
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Tipos de microscopios
Microscopía

• Campo claro
• Campo Oscuro
• Contraste de fase
• Confocal
• Fluorescencia

• Ópticos

Electrónicos

• Transmisión
• Barrido

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Algunos Conceptos
Resolución (D)
Magnificación
Distancia mínima a la cual el equipo puede
mostrar dos puntos como entidades separadas
Aumento que logra el equipo
4
De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos

• 0,5 . ?

D
n . sen?
Cómo disminuir D?
5
Algunos Conceptos
De qué depende la resolución?
FILTRO AZUL
?
Longitud de onda del haz de luz
0,5 .
D
n . sen?
6
Algunos Conceptos
De qué depende la resolución?
?
0,5 .
D
sen?
n .
LENTE CON AN MAYOR
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Algunos Conceptos
De qué depende la resolución?
Es el cambio de dirección que experimenta un rayo
de luz cuando pasa de un medio transparente a
otro también transparente. Este cambio de
dirección está originado por la distinta
velocidad de la luz en cada medio. nAire 1
nAceite1,5
?
0,5 .
D
n
. sen?
Índice de refracción
ACEITE DE INMERSIÓN
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Microscopio óptico
TORNILLOS DE
REVOLVER
EL PORTAOBJETOS
9
Microscopio óptico
10
Microscopio óptico - Campo claro
Eosinofilia
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Microscopio óptico - Campo oscuro
Objetos brillantes sobre un fondo oscuro
Observar organismos vivos sin necesidad de
tinción
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Microscopio óptico - Campo oscuro
Treponema pallidum
13
Aumenta pequeñas diferencias en el índice de
refracción y densidad en la célula
Microscopio óptico - Contraste de fase
Observar organismos vivos sin necesidad de
tinción
El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo
de luz que atraviese la muestra va a retrasarse
respecto del rayo que siga de largo
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Microscopio óptico - Contraste de fase
15
Microscopio óptico - Contraste de fase
Células HeLa (Henrietta Lacks)
Eritrocitos Humanos
Zygnema Filamentous Algae
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Microscopio óptico - Interferencia
Mismo principio que el microscopio de contraste
de fase pero utiliza luz polarizada
Permite la visualización detallada sin
teñir Maximiza la diferencia entre los índices
de refracción entre las partes de la muestra de
forma de hacer visibles los limites celulares
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Microscopio óptico - Contraste de fase e
interferencia
Contraste de fase
Interferencia diferencial
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Los objetos pueden también visualizarse por la
luz que ellos mismos emiten
Microscopio óptico - Fluorescencia
19
Microscopio óptico - Fluorescencia
Algunos objetos fluorescentes
GFP (Green fluorescent protein)
Aequoria victoria
20
(No Transcript)
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Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
22
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
23
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
24
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico
de transmisión (TEM)
25
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico
de transmisión (TEM)
Bacilos en división
Mitocondria 60.000x
Bacteria fagocitada por un macrófago
Herpes virus ensamblándose en el núcleo
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Microscopía electrónica - Microscopio electrónico
de barrido (SEM)
27
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico
de barrido (SEM)
Glomérulo renal 1200x
Espermatozoides bovinos
Piel humana
Célula en corte transversal
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Microscopía electrónica - Microscopio electrónico
de barrido (SEM)
Célula vegetal con cristales (falsa tinción)
Bacterias sobre un estoma
Glób. Rojo
Glób. Blanco
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Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas

• Elevados costos de los equipos  y una
  infraestructura adecuada no permiten el uso de la
  técnica en cualquier laboratorio.
• Altos costos de procesamiento de las muestras
• La manipulación de reactivos se  torna peligroso
  por la elevada condición toxica de los mismos.
• Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de
  artefactos
• La complejidad de los equipos requiere de
  personal técnico especializado.
• Proporciona resultados de amplia resolución y
  magnificación

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Técnicas inmunológicas
31
Técnicas inmunológicas
Introducción a las Técnicas inmunológicas

• ELISA
• Western blot
• Inmunohistoquímica
• Inmunofluorescencia
• Citometría de flujo

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Técnicas inmunológicas - Inmunoglobulinas
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Técnicas inmunológicas - Anticuerpos
Anticuerpo
Linfocito B
epitope
Activación
Antígeno
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Técnicas inmunológicas - Anticuerpos
Antígeno
Epitope A
Epitope C
Epitope B
35
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
Antigeno
Activación
Linfocitos B
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Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
Sangre
Suero
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Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
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Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales
Antígeno
Cultivo de células tumorales
Sangrado

Purificación de Linfocitos B
Fusión
Hibridoma
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Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales
Hibridomas
Screening Búsqueda de hibridoma positivo y
aislamiento
Purificación de anticuerpos monoclonales del
sobrenadante de cultivo de los hibridomas
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ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Para detectar
Antígenos
Anticuerpos
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ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilización
Bloqueo
Incubación con Suero
42
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado
Anticuerpo 2º
Revelado
43
ELISA
ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización
Bloqueo
Incubación con Suero
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ELISA
ELISA Para detectar Antígenos
Lavado
Anticuerpo 2º
Revelado
45
ELISA
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Técnicas inmunológicas - Detección indirecta
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Técnicas inmunológicas - Complejo avidina/biotina
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Técnicas inmunológicas - Detección indirecta
Antígeno
Ac. primario
Ac. secundario
Biotina
Avidina
Peroxidasa
Cromógeno
Cromóforo
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Western blot
Western blot
SDS PAGE
Gel
Transferencia
Membrana
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Western blot
Bloqueo
Anticuerpo 1º
Anticuerpo 2º biotinilado
Avidina-peroxidasa
Revelado

• Sustrato coloreado que precipita al reaccinar
• Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima

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Inmunohistoquímica
Se corta en secciones muy finas y se coloca en un
portaobjetos
Trozo de tejido
Anticuerpo 1º
Anticuerpo 2º biotinilado
Avidina-peroxidasa
Revelado
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Inmunohistoquímica - Sustratos
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Inmunohistoquímica - Revelado
Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción
hematoxilina
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Inmunofluorescencia
55
Inmunofluorescencia
Rat neurons
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Inmunofluorescencia - colocalización
La colocalización permite determinar si dos
antígenos se encuentran en el mismo lugar
(nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una
célula
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Inmunofluorescencia - colocalización
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Citometría de Flujo
Citometría de Flujo
Célula
Medida
En movimiento
Medida de las propiedades de las células mientras
están en un flujo de líquido
Inmunofenotipificación Viabilidad/apoptosis/Prolif
eración Ciclo celular Cambios en la
superficie Actividad enzimática
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Citometría de Flujo
Marcación con anticuerpos monoclonales
Mezcla de células
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Citometría de Flujo
La presión ejercida por una columna de fluido
obliga a las células a enfilarse de a una
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Citometría de Flujo
Columna de células
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Citometría de Flujo
Laser
Detector
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Citometría de Flujo
La luz que se detecta a 90 grados del haz del
laser (side) es detectada por el canal Side
Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal
es proporcional a la cantidad de estructuras
citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones,
etc)
Granularidad
Tamaño
La luz que se detecta en la misma dirección del
laser (forward) es detectada por el canal Forward
Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal
detectada se relaciona con el tamaño, y el indice
de refracción de las células
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Citometría de Flujo
Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a
las estructuras internas, una correlación entre
ellos permiten la diferenciación de los distintos
tipos celulares en una población celular
heterogenea
Linfocitos
RBCs, debris, Células muertas
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Citometría de Flujo - Histograma
Cuentas
Intensidad de fluorescencia
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Citometría de Flujo - Dot Plot
FL2
FL1
67
Citometría de Flujo - Dot Plot
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Citometría de Flujo - Cell sorting
69
Citometría de Flujo
70
Citometría de Flujo