Cuidados B

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Cuidados Básicos no Laboratório de Genética
Molecular
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Cuidados Básicos no Laboratório de Genética
Molecular

• PROTEGER A AMOSTRA
• DNAses/RNAses
• Luvas
• Cobertas de banca
• Materiais M.B. Grade
• Descontaminar bancas...

• EVITAR CONTAMINAÇÕES
• Pontas de filtro
• Luvas
• 3 Zonas Distintas
• Descontaminar bancas...

• PRECISÃO MÁXIMA
• Confirmar volumes
• Tempos e Temperaturas exactos

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PREPARAÇÃO DE DNA E RNA

• DNAses e RNAses
• Omnipresentes em todo o material biológico
• Função biológica essencial
• Presentes em todo o material de vidro e de
  plástico não tratado convenientemente
• Presentes em químicos não Mol.Biol.Grade
• Presentes nas mãos de todo o pessoal de
  laboratório

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Descontaminar bancas e equipamento
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Pontas para múltiplos volumes
6
Pontas com marcas de volume
7
Pontas para tubos longos
8
Pontas para Geis
9
Pontas para DNA Genómico
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Os tubos eppendorf
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Preparação de Ácidos Nucleicos
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Preparação das célulaspulverização pós
congelação
13
Preparação das célulashomogeneização
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Preparação das células do sangueCentrifugação
em gradiente descontínuo de densidade (Ficoll)
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Preparação das células do sangueLise dos
eritrócitos
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PREPARAÇÃO DE DNA E RNA

• DNA e RNA de mamiferos
• Lise suave e solubilização do DNA/RNA
• Destruição enzimática das proteínas (proteases)
• Destrição e precipitação quimica das proteínas
  (fenol/clorofómio/ácido isoamilico)
• Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de
  amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio)
• Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia remoção
  de sais)

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Método do fenol/ clorofórmio
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Método do salting-out
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PREPARAÇÃO DE DNA E RNA

• DNA e RNA bacteriano
• Como a dos mamíferos, mas é necessário ser eficaz
  na separação de polissacáridos, muito abundantes
  em algumas bactérias
• CsCl
• Enzimas
• Lisozima
• Lisostafina
• etc

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Ultracentrifugação em gradiente de densidade
(CsCl)
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Separação de ácidos nucleicos por cromatografia
de troca iónica
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Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do
pH
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Colunas de sílica (ex. Qiagen)
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Sílica Magnética
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MagnaLyser