CHUONG I - C

1
CHUONG I - CÁC K? THU?T CHÍNH C?A CÔNG NGH? SINH
H?C HI?N Ð?I
2
BÀI 1CÔNG NGH? DNA TÁI T? H?P
3

• Công ngh? DNA tái t? h?p, còn du?c g?i là nhân
  dòng gen hay nhân dòng phân t?, là m?t khái ni?m
  bao quát g?m m?t s? quy trình thí nghi?m d?n d?n
  vi?c chuy?n thông tin di truy?n (DNA) t? sinh v?t
  này sang sinh v?t khác.

4
TH? NÀO LÀ DNA TÁI T? H?P
5
I. THU NH?N GEN

• Vào nam 1969, Becwitt, Shapiro dã thông báo v?
  công trình tách gen t? operon lactose c?a E. coli
  d?a trên co s? k?t h?p các phuong pháp di truy?n
  vi sinh c? di?n v?i các phuong pháp v?t lý d?
  tách và lai các phân t? DNA.
• Có th? thu nh?n gen d? th?c hi?n k? thu?t tái t?
  h?p DNA b?ng ba phuong pháp khác nhau.

6
1.Tách d?an ADN ch?a gen t? b? gen

• Toàn b? DNA du?c tách ra nh?ng do?n nh? có chi?u
  dài 15.000 20.000 c?p base b?ng phuong pháp l?c
  co h?c hay b?ng enzyme c?t h?n ch?. Sau dó g?n
  vào các vector mang gen t?o thành plasmid tái t?
  h?p.
• Phuong pháp này thu?ng cho các do?n DNA có kích
  thu?c khác nhau và không xác d?nh chính xác do?n
  DNA ta mong mu?n. Tuy nhiên phuong pháp này v?n
  d?oc dùng trong vi?c t?o ra thu vi?n gen hay
  ngân hàng gen.

7
2.T?ng h?p b?ng phuong pháp hóa h?c

• B?ng hi?u bi?t v? trình t? và s? s?p x?p các
  nucleotide trên gen, các acid amin trong chu?i
  polypeptide mà ngu?i ta có th? t?ng h?p d?oc các
  do?n gen mong mu?n b?ng phuong pháp hóa h?c.

8
3.Sinh t?ng h?p gen t? mARN tuong ?ng

• Nguyên t?c c?a phuong pháp là d?a vào kh? nang
  ho?t d?ng c?a enzyme phiên mã ngu?c.
• Enzyme này có kh? nang t?ng h?p nên DNA m?t m?ch
  (cDNA complementary DNA) t? khuôn mARN ho?c
  cung có th? t? m?t do?n polyribonucleotide thu
  nh?n d?oc t? quá trình t?ng h?p hoá h?c.

9
II. VECTOR TÁCH DÒNG

• Vector tách dòng (cloning vector) g?m nhi?u lo?i
  nhu plasmid, phage, cosmid, virus, .M?i lo?i
  vector tách dòng có nh?ng uu, nhu?c di?m nh?t
  d?nh. Tùy thu?c kích thu?c c?a gen tách dòng và
  d?c di?m c?a lo?i t? bào ch? d? ch?n lo?i vector
  tách dòng thích h?p.

10
1. Các vector d?i v?i E.coli

• Các vector tách dòng don gi?n nh?t, du?c s? d?ng
  r?ng rãi nh?t là d?a trên các plasmid vi khu?n.
  M?t lu?ng l?n các vector plasmid khác nhau có th?
  s? d?ng cho E.coli.
• Uu di?m c?a các vector này là d? làm s?ch, hi?u
  qu? bi?n n?p cao, các marker ch?n l?c thu?n ti?n
  cho bi?n n?p và tái t? h?p, có kh? nang tách dòng
  các m?u DNA l?n t?i 5kb.

11
PLASMID
12
2. Vector d?i v?i n?m men và các n?m khác

• N?m men S.cerevisiae là m?t trong nh?ng co th?
  quan tr?ng nh?t trong công ngh? sinh h?c.

13
3.Vector d?i v?i th?c v?t b?c cao

• Vector tách dòng là vi khu?n A. tumefaciens
• A. tumefaciens là VK Gram (-), t?o nên các n?t
  s?n trên cây tr?ng khi b? nhi?m.
• Vi?c t?o nên các n?t s?n chính là k?t qu? c?a
  vi?c chuy?n do?n T-DNA c?a plasmid Ti vào b? gen
  t? bào th?c v?t.

14

• Vector tách dòng là virus Cauliflower mosaic
• H?u h?t virus th?c v?t là virus RNA nên r?t khó
  bi?n n?p, ch? có Geminvirus và Caulimovirus
  (CaMV) là virus DNA.

15
4. Vector d?i v?i t? bào d?ng v?t có vú

• Vector d?a trên SV40
• - SV40 (Simian virus) có kh? nang gây nhi?m m?t
  s? loài d?ng v?t có vú.
• - B? gen c?a SV40 nh? (kho?ng 5,2kb) và ch? dung
  h?p du?c vài tram nucleotide.

16

• Vector virus khác c?a d?ng v?t có vú
• Bovine papilloma virus (BPV) ch? y?u gây ra m?n
  cóc trên bò nhung cung gây nhi?m trên các loài
  khác. Trong các t? bào chu?t, BPV có nhi?u b?n
  sao 100 phân t?/t? bào.

17
III. ENZYME GI?I H?N VÀ M?T S? ENZYME THU?NG DÙNG

• 1. Enzyme gi?i h?n
• Enzyme gi?i h?n (Restriction enzyme RE) có d?c
  tính c?t DNA không d?c hi?u loài. S? lu?ng và
  kích thu?c d?an c?t dài hay ng?n tùy thu?c vào s?
  lu?ng di?m gi?i h?n trên phân t? DNA.

18

• M?i dòng t? bào và vi khu?n d?u có h? th?ng
  enzyme c?t h?n ch? chuyên bi?t, các enzyme này có
  kh? nang phân bi?t DNA c?a mình và do?n DNA l?,
  do dó nó không c?t DNA c?a chính mình hay DNA dã
  thích nghi v?i t? bào.

19
a.Tên g?i các enzyme
Tên enzyme Chi, loài Gi?ng Ch?ng Th? t? dòng
EcoRI Escherichia coli Ry13 I
SmaI Serratia martesens I
HaeIII Hemophylus aegypticus III
20
b. Các lo?i enzyme gi?i h?n

• Hi?n nay có hàng nghìn enzyme gi?i h?n du?c ly
  trích t? vi khu?n. D?a vào kh? nang nh?n bi?t và
  c?t các trình t? d?c hi?u kho?ng 4 6 c?p
  nucleotide ngu?i ta chia enzyme gi?i h?n làm 3
  lo?i
• Lo?i th? nh?t
• Lo?i th? hai
• Lo?i th? ba

21
c.Các ki?u c?t c?a enzyme gi?i h?n

• M?i enzyme gi?i h?n nh?n bi?t và c?t d?c hi?u m?t
  do?n DNA ? nh?ng v? trí nh?t d?nh. Có hai ki?u
  c?t khác nhau là c?t t?o d?u b?ng và c?t t?o d?u
  so le.

22

• C?t t?o d?u b?ng (Blunt ends) m?t s? RE c?t 2
  m?ch DNA t?i cùng m?t di?m. Sau khi c?t, hai d?u
  b?ng s? không có kh? nang t? k?t h?p tr? l?i. Ð?
  n?i chúng l?i ph?i dùng enzyme T4 ligase.
• C?t t?o d?u dính (cohesive ends) ? m?t s? RE, v?
  trí c?t l?ch nhau trên hai m?ch. Trong tru?ng h?p
  này, các d?u dính b? sung có th? b?t c?p tr? l?i.

23

• Ðo?n ADN l? và vector khi du?c c?t b?i cùng m?t
  l?ai enzyme c?t h?n ch? s? có th? n?i l?i v?i
  nhau nh? enzyme n?i Ligase
• Ngu?i ta s? d?ng tính ch?t này d? c?t và ghép gen.

24
2. M?t s? enzyme thu?ng s? d?ng trong k? thu?t gen

• a. Enzyme polymerase Là các enzyme xúc tác quá
  trình tái b?n DNA, phiên mã t?ng h?p RNA.
• - Enzyme DNA polymerase I (pol I)
• - Enzyme T4 DNA polymerase
• - Enzyme Taq polymerase
• - Enzyme RNA polymerase

25
b. Enzyme DNA ligase

• Enzyme ligase là các enzyme xúc tác hình thành
  các liên k?t, n?i 2 do?n acid nucleic v?i nhau.
• - Enzyme T4 DNA ligase
• - Enzyme T4 RNA ligase

26
c. Các enzyme nuclease

• - Enzyme DNase I
• - Nuclease S1
• - RNase A
• - RNase H

27
IV. DNA TÁI T? H?P

• Công ngh? DNA tái t? h?p là t?p h?p các k? thu?t
  g?n xen ho?c n?i các gen l? (các do?n DNA ngo?i
  lai) c?n thi?t vào vector tách dòng, t?o vector
  tái t? h?p, chuy?n vector tái t? h?p vào t? bào
  ch? d? vector tái t? h?p du?c nhân lên v?i m?t
  lu?ng l?n b?n sao trong t? bào ch?.

28

• Các phuong pháp t?o DNA tái t? h?p
• N?i các do?n DNA nh? enzyme n?i
• C?i ti?n d?u dây nh? các do?n linker
• Phuong pháp t?o duôi homopolymer

29
1. T?o DNA tái t? h?p b?ng enzyme n?i
30
2. C?i ti?n d?u dây nh? các do?n linker
31
3. Phuong pháp t?o duôi homopolymer