REPLICACI

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REPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO

• El ADN es la macromolécula depositaria de la
  información genética.
• Metabolismo de la información procesos que
  intervienen en el almacenamiento, recuperación,
  procesamiento y transmisión de la información
  genética (Figura 1). Los principales procesos de
  este metabolismo son la replicación (el ADN, o
  ARN en algunos virus, actúa de molde para su
  propia síntesis), la transcripción (la
  información codificada en el ADN determina la
  estructura de los ARNs) y la traducción (el ARN
  actúa como molde para la síntesis de una
  proteína). Estos 3 procesos tienen en común la
  necesidad de un molde y el desarrollarse en 3
  etapas centrales iniciación, elongación y
  terminación.
• Tomaremos como modelo E. coli.

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CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO DE REPLICACIÓN DEL ADN

• 1)LA REPLICACIÓN DEL ADN ESTÁ COORDINADA CON EL
  CICLO DE CRECIMIENTO Y DIVISIÓN CELULAR.
• 2)LA REPLICACIÓN ES SEMICONSERVATIVA
• Según Watson y Crick las dos cadenas del ADN son
  complementarias y cada una actúa como molde para
  la síntesis de la hebra complementaria, da lugar
  a dos moléculas de ADN duplohelicoidal idénticas
  al ADN original, de modo que cada ADN contiene
  una hebra vieja y una nueva.
• Este postulado fue confirmado por Stahl en 1957
  cultivaron durante varias generaciones E. colicon
  N15, de modo que todos los componentes
  nitrogenados de la célula contendrían N15 y por
  tanto al centrifugar en gradiente con cloruro de
  cesio tendrían mayor densidad de sedimentación el
  ADN marcado con N15 y no con N 14. Posteriormente
  transfieren las bacterias al ADN con un medio con
  N14, se extrae el ADN, se centrifuga en gradiente
  de cesio y se obtiene una banda con densidad de
  centrifugación intermEdia que corresponde al ADN
  híbrido. Tras una segunda generación se repitió
  el experimento y se aisló el ADN y se centrifugó
  en gradiente de clouro de cesio obteniéndose una
  banda a medio caminno y una banda a elevado nivel
  o ADN ligero.

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• 3) LA REPLICACIÓN COMIENZA EN UN PUNTO DE ORIGEN
  Y ES BIDIRECCIONAL
• Se plantean a nivel de replicación una serie de
  interrogantes
• - Se desenrrollan totalmente las cadenas de ADN
  parental para que cada una sea replicada?
• - Dónde comienza la replicación en sitios al
  azar o en un punto único?
• - Si se inicia en un punto se da en una
  dirección o en ambas?

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• John Cairns proporcionó la primero indicación de
  que la preplicación es un proceso altamente
  coordinado en el que las dos hebras parentales se
  desenrrollan y se replican simultáneamente.
• Esta hipótesis se confirmó aislando y examinando
  el cromosoma de E. coli (bacteria que vive en
  nuestro intestino grueso y contienen un cromosoma
  circular y puede contener otros ADN en forma de
  plásmidos, que pueden contener más de una copia
  de 3 a 100 genes y pueden contener más de una
  copia una misma célula.
• Cairns cultivó E. coli durante una generación o
  1,5 generaciones en un medio con timidina
  tritiada. En la primera generación originó una
  progenie que contenía una hebra marcada
  radioactivamente y otra hebra no. La primera
  generación obtuvo bacterias y mediante
  autorradiografía examinó el ADN, su
  radioactividad reveló el cromosoma entero y la
  segunda revelaba ADN incorporado de novo. Al
  analizar la película fotográfica observó un nuevo
  lazo en forma de letra griega tedta. La zona de
  intersección entre las dos zonas responsables y
  no replicadas se llama horquilla de replicación.
• Para explicar si era mono o bidireccional se
  observó que la mayor radioactividad se sitaba en
  las dos horquillas de replicación, lo que
  indicaba que la replicación era bidireccional.
• Otros experimentos indicaron que la replicación
  se iniciaba en un punto único denominado OriC u
  origen de repliación. Es un gen de 245 pb con
  cuatro secuencias repetidas.

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• 4) La síntesis de ADN transcurre en dirección 5
  ? 3 y es semidiscontinua
• Las cadenas de ADN siempre son sintetizadas en la
  dirección 5 ? 3, siendo el 3OH libre el punto
  de elongación del ADN. Debido a que las cadenas
  de ADN son antiparalelas, la cadena que actúa de
  molde es leída del extremo 3 al 5.
• Si la síntesis transcurre siempre en la dirección
  5 ? 3, cómo pueden sintetizarse
  simultáneamente las dos cadenas? Si las dos
  cadenas fuesen sintetizadas continuamente a
  medida que avanza la horquilla de replicación,
  una tendría que se sintetizada en dirección 3 ?
  5. Este problema fue resuelto por Reiji Okazaki
  y col en la década de 1960, al descubrir que una
  de las cadenas es sintetizada en forma de trozos
  cortos, denominados fragmentos de Okazaki. Este
  trabajo condujo a la conclusión de que una de las
  cadenas es sintetizada de forma continua y la
  otra discontinua (Figura 4). La cadena continua o
  cadena conductora es aquella cuya síntesis en
  dirección 5 ? 3 transcurre en la misma
  dirección que el movimiento de la horquilla de
  replicación. La cadena discontinua o cadena
  rezagada es aquella cuya síntesis en dirección 5
  ? 3 transcurre en dirección opuesta a la
  dirección del movimiento de la horquilla. Como
  veremos más adelante, la síntesis de la hebra
  conductora y rezagada están estrechamente
  coordinadas.

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• 5) EL ADN ES SINTETIZADO POR LAS ADN POLIMERASAS

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PROCESO GLOBAL DE REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS

• La síntesis de una molécula de ADN es un proceso
  muy complejo en el que participan, además de las
  ADNp, 20 o más enzimas y proteínas diferentes y
  que se puede dividir en tres fases iniciación,
  elongación y terminación. Estas fases se
  distinguen por las reacciones que tienen lugar y
  por las enzimas implicadas y reflejan la
  información obtenida de experimentos en E. coli.

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1. Iniciación

• La replicación del cromosoma de E. coli se inicia
  en una secuencia de origen denominada oriC. Este
  origen consta de 245 pb y contiene secuencias muy
  conservadas entre los orígenes de replicación
  bacterianos. Las secuencias clave son dos series
  de repeticiones cortas una de las series consta
  de tres repeticiones de una secuencia de 13 pb,
  con una cantidad abundante de A y T (puede
  desnaturalizarse con facilidad) y la otra serie
  está formada por cuatro repeticiones de una
  secuencia de 9 pb. (Figura. 10)
• En la fase de iniciación de la replicación
  participan al menos ocho enzimas o proteínas
  diferentes (tabla 2). Éstas se encargan de abrir
  la hélice del ADN en el origen y establecen un
  complejo precebador para las reacciones
  posteriores (Figura 11). El componente clave en
  el proceso de iniciación es la proteína DnaA. Un
  complejo formado por unas 20 moléculas de
  proteína DnaA se une a las cuatro repeticiones de
  9 pb en el origen, a continuación reconoce y
  sucesivamente desnaturaliza el ADN en la región
  de las repeticiones de 13 pb. Este proceso
  requiere ATP y la proteína bacteriana HU, del
  tipo de las histonas, que facilita que el ADN se
  doble y desenrolle. Seguidamente, la proteína
  DnaB se une a esta región, en una reacción que
  requiere la proteína DnaC. Dos hexámeros de DnaB,
  uno en cada horquilla, actúan de helicasa,
  desenrollando el ADN de manera bidireccional y
  creando dos horquillas de replicación
  potenciales. Simultáneamente muchas moléculas de
  la proteína de unión al ADN de cadena sencilla
  (SSB) se fijan de manera cooperativa al ADN,
  estabilizando las cadenas separadas e impidiendo
  su renaturalización. Otra enzima, la ADN girasa
  (una ADN topoisomerasa) alivia la tensión
  topológica creada por la DnaB helicasa.

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• La iniciación es la única fase de la replicación
  que está regulada, de modo que sólo tenga lugar
  una vez cada ciclo celular.
• Incluso con el molde de ADN expuesto, no se puede
  sintetizar un nuevo ADN a menos que se construya
  un cebador. Recordemos que todas las ADNp
  conocidas necesitan un cebador con un grupo OH
  libre en el extremo 3 para sintetizar ADN en
  dirección 5 ? 3. Kornberg descubrió que durante
  la replicación había sobre el ADN pequeñas
  cantidades de ARN. Este ARN, de entre 10 y 60
  nucleótidos, es precisamente el que hace de
  cebador y es sintetizado por la enzima primasa
  (proteína DnaG, que es una ARN polimerasa, las
  cuales, como veremos después, no necesitan
  cebador) y sobre el que la ADNp III añade
  desoxirribonucleótidos en la fase de elongación.

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2. Elongación

• La fase de elongación consiste en dos operaciones
  distintas pero relacionadas la síntesis de la
  hebra conductora y la síntesis de la hebra
  rezagada.
• La síntesis de la hebra conductora empieza con la
  síntesis del cebador de ARN por la primasa en el
  origen de replicación. A continuación la ADNp III
  adiciona desoxirribonucleótidos a este cebador.
  Una vez iniciada, la síntesis de la hebra
  conductora transcurre de manera continua, al
  mismo ritmo que el desenrollamiento del ADN en la
  horquilla de replicación.
• La síntesis de la hebra rezagada se realiza a
  trozos. Primero, un cebador de ARN es sintetizado
  por la primasa y, como en la síntesis de la hebra
  conductora, la ADNp III se une al cebador de ARN
  y añade desoxirribonucleótidos. A este nivel, la
  síntesis de los fragmentos de Okazaki parece
  sencilla, pero es en realidad muy compleja. Esta
  complejidad reside en la coordinación de la
  síntesis de las hebras conductora y rezagada,
  puesto que ambas hebras son producidas por un
  único dímero asimétrico de ADNp III. Para ello la
  hebra molde de la cadena rezagada forma un bucle
  para aproximar los dos puntos de polimerización y
  conseguir que las dos cadenas en síntesis tengan
  la misma polaridad.

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• La síntesis de los fragmentos de Okazaki pone en
  juego complejas actividades enzimáticas (Figura
  13). La helicasa DnaB y la primasa constituyen
  una unidad funcional dentro del complejo de
  replicación, denominada primosoma. La ADNp III
  usa un juego de subunidades núcleo (polimerasa
  núcleo) para la síntesis continua de la hebra
  conductora, mientras que el otro juego de
  subunidades núcleo circula entre un fragmento de
  Okazaki y el siguiente sobre el bucle. A medida
  que el ADN es desenrollado por la helicasa DnaB
  en la horquilla de replicación, la primasa
  ocasionalmente se asocia con la helicasa DnaB y
  sintetiza un corto cebador de ARN. Una nueva
  abrazadera deslizante ß es entonces posicionada
  en el cebador por el complejo cargador de la
  abrazadera de la ADNp III. Cuando se ha
  completado la síntesis de un fragmento de
  Okazaki, la replicación se detiene y las
  subunidades núcleo de la ADNp III se disocian de
  su abrazadera deslizante y se asocian con la
  siguiente. Ello inicia la síntesis de un nuevo
  fragmento de Okazaki.
• EL proceso permite la síntesis de unos 1000
  nucleótidos por segundo en cada hebra. Una vez
  finalizada la síntesis de un fragmento de
  Okazaki, su cebador es eliminado y reemplazado
  con ADN por la ADNp I (actividad exonucleasa 5 ?
  3 y polimerasa, respectivamente) y la mella
  restante es sellada por una ADN ligasa (Figuras
  14 y 15).
• La ADN ligasa cataliza la formación de un enlace
  fosfodiéster entre un OH 3, al final de un
  fragmento, y un fosfato 5 al final de otro
  fragmento. La energía necesaria se obtiene
  acoplando la reacción a la escisión de NAD (E.
  coli y otras bacterias) o de ATP (eucariotas y
  algunos virus).

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3. Terminación

• Finalmente, las dos horquillas de replicación del
  cromosoma circular de E. coli se encuentran en
  una región terminal que contiene múltiples copias
  de una secuencia de 20 pb denominada Ter (por
  terminal). Las secuencias Ter actúan en el
  cromosoma como una especie de trampa donde una
  horquilla de replicación puede entrar pero no
  salir (Figura 16). Las secuencias Ter son lugares
  de unión para una proteína denominada Tus (por
  sustancia de utilización del terminal en inglés).
  El complejo Ter-Tus puede detener la replicación
  desde una sola dirección. Sólo actúa un complejo
  Ter-Tus por ciclo de replicación. Cuando una
  horquilla de replicación topa con un complejo
  Ter-Tus se detiene la otra horquilla se detiene
  cuando encuentra a la primera ya detenida. Los
  pocos centenares de pares de bases finales entre
  estos grandes complejos proteicos son replicados
  a continuación mediante un mecanismo aún
  desconocido. El resultado son dos cromosomas
  circulares ligados en el espacio. Los círculos de
  ADN unidos de este modo se denominan
  concatenados su separación requiere, en E. coli,
  una topoisomerasa. Los cromosomas separados son
  segregados en las células hijas en la división
  celular.