Procedimientos de Biolog

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Procedimientos de Biología Molecular para el
estudio de la infección por el VIH
Mariam Cortés Tormo R3 Análisis clínicos Hospital
Virgen de los Lirios Alcoy
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Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH)
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Pasos en la infección del VIH
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Métodos de detección VIH

• Los métodos indirectos permiten la detección de
  anticuerpos específicos anti-VIH siendo la forma
  habitual de diagnosticar una infección por VIH y
  se dividen en
• Pruebas de screening
• Inmunoenzimáticas (EIA)
• Pruebas confirmatorias
• Western Bloot (WB)
• Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
• Radioinmunoprecipitación (RIPA)
• Los métodos directos detectan el virus o alguno
  de sus componentes
• Cultivo vírico
• Determinación p24 en suero o plasma
• Técnicas de biología molecular

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Métodos de detección indirectosVIH

• Pruebas de screening (EIA)
• HIV Ag/Ab Combo (ARCHITECT)
• HIV combi (MODULAR E-170)
• Pruebas confirmatorias Western Bloot
• INNO-LIA HIV I/II Score (INNOGENETICS)

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Métodos de detección indirectosVIH

• Pruebas de screening (EIA)
• HIV Ag/Ab Combo (ARCHITECT)
• Inmunoensayo de micropartículas
  quimioluminiscentes
• No distingue entre VIH-1/ VIH-2

Señal directamente proporcional a Ac
VIH-1/VIH-2 Ag p24 en SUERO
Ac antiAc VIH1/VIH2 mAc p24 DIMETIL ACRIDINIO
(DMAE)
SUERO Ac VIH-1/VIH-2 Ag p24
rAg VIH-1/VIH-2 mAc p24
H2O2 Sol. Alcalina
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Métodos de detección indirectosVIH

• Pruebas de screening (EIA)
• HIV combi (MODULAR E-170)
• Electroquimioluminiscencia en sandwich
• No distingue entre VIH-1/ VIH-2

mAc p24- biotina mAc p24- rutenio
MUESTRA Ag p24
Micropartículas- estreptavidina
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Métodos de detección VIH

• Prueba confirmatoria (EIA)
• INNO-LIA HIV I/II Score (INNOGENETICS)
• Tiras de nylon cubiertas con Ag

• En las cubetas de plástico
• Tiras nylon
• 1mL Diluyente
• 10 µL Muestra
• Incubar 16 2h RT
• Lavar con Solución Lavado
• 1mL Conjugado (30min RT)
• Lavar con Solución Lavado
• 1mL Sustrato (30 min RT)
• 1mL Solución Parada
• Secado
• Lectura

sgp120 gp41 p31 p24 p17 sgp105 gp36
VIH-1
VIH-1/ VIH2
VIH-2
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Métodos de detección directos VIH

• Técnicas de Biología molecular
• Han permitido
• Observar que el VIH se produce durante todas las
  fases de la infección
• Nivel de producción relacionado con la progresión
  de la enfermedad
• Se emplean en
• Diagnóstico cuando el test serológico ha sido
  equívoco
• Sospecha transmisión materno-filial
• Estudios variación genómica
• Monitorización terapia antirretroviral
• Técnicas empleadas
• PCR altamente sensible
• Prueba del DNA ramificado (bDNA)
• Amplificación basada en la secuencia de ácidos
  nucleicos (NASBA)

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Métodos de detección directos VIH

• RT-PCR
• Control interno de cuantificación
• se resuelven los problemas que
• se han podido dar en las etapas
• de aislamiento y amplificación.
• Detección ? quimioluminiscencia/
• fluorescencia
• Microplaca
• Pocillos con diluciones seriadas
• del producto de reacción
• Hibridación
• Lectura placa a una ? determinada
• Resultados basados en el control
• interno

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Métodos de detección directos VIH

• bDNA Amplificación de una señal que se liga al
  RNA viral

Ultracentrifugación
Determinación de la carga viral en función de la
lectura de la placa muestra y los pocillos control
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Métodos de detección directos VIH

• NASBA
• Etapas
• Extracción y purificación unión ácidos nucleicos
  a partículas de sílice o cristal en presencia de
  tiocianato de guanidinio (lisa y evita la
  actuación RNAsas y DNAsas)
• Amplificación

T7 promotor de RNApol
Se añaden calibradores internos junto con la
muestra (QA/QB/QC en C relativa de 100/10/1)
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Métodos de detección directos VIH

• NASBA
• Etapas
• Cuantificación
• Requiere adición de estándares internos. Métodos
• Introducción lugar único de restricción en la
  molécula estándar
• Ventaja diferencia blanco de estándar por
  digestión enzimática y no altera eficiencia
  amplificación
• Inconveniente amplificación excesiva genera
  heteroduplex que impiden acción de enz.
  restricción y sobreestima el pico inicial
• Introducción inserción o deleción en molécula
  estándar
• Ventaja buena diferenciación entre blanco y
  estándar
• Inconveniente alteración eficiencia
  amplificación
• Reemplazamiento de una parte del estándar por un
  tramo único de nucleótidos complementarios a la
  sonda específica del estándar
• Ventaja amplificación no competitiva al
  presentar distintas regiones de intervención y
  por lo tanto se evita la hibridación entre las
  dos cadenas
• Detección
• Electroquimioluminiscencia

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Métodos de detección directos VIH

• Principales diferencias entre las técnicas
• Instrumentación
• bADN sólo necesita un lector de placas
• RT-PCR, además de un lector de placas emplea un
  termociclador especial
• NASBA se vale de un instrumento semiautomático de
  detección por electroquimioluminiscencia
• Tanto la prueba del bADN como la del NASBA
  incluyen un programa informático específico
• Volúmenes de muestra necesarios
• RT-PCR 200 µL
• NASBA 100 µL
• bADN 1 mL por duplicado. La disponibilidad de
  muestra limitaba muchas veces la práctica de esta
  técnica
• - En todos los casos se recomiendan muestras de
  plasma, aunque el NASBA se puede realizar
  directamente a partir de suero, sangre total,
  líquido cefalorraquídeo, semen y orina. La prueba
  de RT-PCR no puede realizarse a partir de plasma
  heparinizado, ya que por sus características
  quelantes, la heparina inhibe la PCR
• El límite de detección
• bADN 10.000 copias por mL.. Las pruebas de 2a y
  3a generación del bADN pueden detectar hasta 500
  y 25 copias por mL, respectivamente con una
  excelente reproducibilidad.
• RT-PCR 200-400 copias de ARN por mL.. Una prueba
  de RT-PCR de 2a generación permite detectar hasta
  20 copias de ARN por mL de plasma.
• El NASBA 4.000 copias de ARN del VIH.
• Obtención de resultados
• 24 horas para RT-PCR y NASBA
• 48 horas para el bADN.
• - Rendimiento, se procesan 42 muestras con la
  técnica del bADN, 22 con la prueba de RT-PCR y 10
  con la del NASBA.

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Métodos de detección directos VIH

• Principales aplicaciones de la Biología Molecular
• Estudio de la dinámica viral
• Carga viral y monitorización de la terapia
• Nuevas técnicas de optimización terapéutica
• Tipación de HLA-B5701 Hipersensibilidad a
  Abacavir en presencia del alelo
• Ensayos de tropismo CCR5/CXCR4 y sensibilidad a
  Maraviroc

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Métodos de detección VIH(procedimiento en
nuestro laboratorio)

• SUERO/PLASMA

EMBARAZO
NEGATIVO
NEGATIVO
POSITIVO
VIHTA
POSITIVO
NEGATIVO
POSITIVO
17

• MUCHAS
• GRACIAS