Interferenza e vettori 27-X-06

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Interferenza e vettori 27-X-06
Per reprimere lattività genica metodo
definitivo knock out di un gene, metodo
temporaneo prima antimessaggeri, ora
interferenza
Lantimessaggero ha unazione meccanica
(appaia il messaggero)
Linterferenza è un sistema enzimatico complesso
È un sistema fisiologico
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Come si può fare interferenza
Vediamo come si può dimostrare che esiste
linterferenza e che se si inibisce ricomincia
lattività enzimatica su cui abbiamo interferito
Si tratta di fare degli esperimenti che osservano
il fenomeno e poi di dimostrare il meccanismo con
cui si verifica
Per dimostrare che il meccanismo identificato è
il responsabile effettivo dellinterferenza devo
avere un modello in cui funziona linterferenza e
poi devo bloccare linterferenza (in un punto del
pathway) e ripristinare lespressione bloccata
dalla interferenza.
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Espressione di emerald GFP

• B) Cells transfected with Lipofectamine 2000
  (efficiency 50)
• - 100 tracking of EmGFP and miRNA expression.
• -1 Hoechst nuclear stain After 48 hours,
• cells stained with a red lamin stain, and
  monitored for GFP expression.
• 2 half of the cells express lamin protein
• 3 cells expressing EmGFP and lamin A/C stained
  are combined,
• cells expressing GFP do not appear to have lamin
  A/C present,
• cells stained red for lamin A/C do not appear to
  have any GFP expression.
• This demonstrates that cells expressing EmGFP
  are also all greatly reduced in lamin expression
  due to the presence of the miRNA that is
  co-cistronically expressed. Come è il costrutto ?

vettore GFPlamina siRNA
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espressione di un micro RNA
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Come sarà il costrutto ?
se dobbiamo esprimere la GFP e inibire
lespressione di Lamin A/C
lamin A/C siRNA small interfereing mi micro
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Interference come difesa
A brief history of RNAi the silence of the
genes. Sen GL, Blau HM. Department of Molecular
Pharmacology, Baxter Laboratory in Genetic
Pharmacology, 269 Campus Dr., CCSR 4225A,
Stanford University School of Medicine, Stanford,
California 94305, USA. gsen_at_stanford.edu The
use of the RNA interference (RNAi) pathway to
eliminate gene products has greatly facilitated
the understanding of gene function. Behind this
remarkable pathway is an intricate network of
proteins that ensures the degradation of the
target mRNA. In this review, we explore the
history of RNAi as well as highlighting recent
discoveries. FASEB J. 2006 Jul20(9)1293-9.
PMID 16816104 PubMed - indexed for MEDLINE
1 paper plant cell (petunia) 1990 2 Neurospora
1992 Sistema enzimatico Dicer 1998-2000
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Dimostrazione tramite esperimenti di controllo
Dimostrazione soppressione con antisenso
RNA linterferenza è ? dal blocco con
antimessaggero ?
Come lo dimostrereste ?
Un antimessaggero può legare il messaggero e
bloccarne il funzionamento (va trasfettato nella
cellula)
Piccoli RNA possono bloccare lespressione di un
gene osservazione in piante (x cambiar colore
alle petunie)
osservazione di silenziamento (quelling) in
Neurospora crassa
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Esperimenti tramite vettori
Per ogni esperimento un vettore con
caratteristiche specifiche
tramite tecniche di DNA ricombinante e trasfezioni
vettori di controllo con e senza inserto
I exp. overexpression in petunia del gene
chalcone syntase biosintesi antocianine -
colore viola dei fiori fiori binchi
repressione dellespressione (90) II exp.
Neurospora crassa (Romano e Macino) sequenze
omologhe di geni inibivano temporaneamente
specificamente lattività di molti geni
(92) III exp. Caenorabditis elegans sequenze
senso ed antisenso inibiscono il gene par 1
(gene della partizione) (98) IV exp. Verifica
che è il dsRNA a innescare linterferenza

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Altre evidenze di RNAi
Gli esperimenti a singola elica di RNA erano
contaminati da dsRNA
Mancavano i controlli giusti di purificazione
dell RNA
Exp con singolo filamento senso o
antisenso 10-100 volte minor efficienza rispetto
a dsRNA
Ipotesi di un prodotto intermedio stabile
Exp in C.elegans mostrava interferenza nella II
generazione
Isolamento di un piccolo RNA da 25 nt antisenso
Exp in cellule di Drosofila con firefly
luciferase interferenza con dsRNA 22-23nt con
sporgenza libera di 2-3 nt. Si inibisce sia il
gene esogeno che endogeno
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Interferenza nei mammiferi
Nelle cellule di mammifero dsRNA lunghi inducono
interferone e blocco della sintesi proteica
(traduz.) - alternativa prova con dsRNA corti
Ipotesi di funzionamento in 2 passaggi 1
taglio del dsRNA in piccoli frgm 22-23nt 2
taglio del mRNA specifico
Exp. di centrifugazione per separare le due
attività
nel surnatante resta solo attività di taglio del
dsRNA
Ipotesi di attività ribonucleasica della famiglia
delle Rnase-III
Exp. costrutti con epitopo tag T7 di fusione a
RNAse (tipo 1-2-3) che funge da carrier,
trasfezione in cellule S2 di Drosofila,
immunoprecipitazione, 1 solo enzima che taglia
dsRNA in frammenti di 21-23nt. L enzima viene
chiamato DICER legato ad Rnase di tipo
III. Mutante KO perde attività di interference.
Omologhi di DICER in tutte le specie
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Cosa è limmunoprecipitazione
La tecnica di immunoprecipitazione la dovreste
conoscere, però in poche parole
Molti enzimi formano dei complessi oppure
interagiscono con altri enzimi, proteine o DNA
immunoprecipitazione con uno degli enzimi del
complesso da studiare
Si deve avere un buon anticorpo non deve
interagire col sito attivo che lega laltro enzima
Viene fatto lestratto cellulare e si fa reagire
con lanticorpo contro la proteina, la
precipitazione dellanticorpo con la proteina fa
da carrier per le altre proteine legate
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Immunoprecipitazione e artefattiin breve I
La tecnica ha molti rischi di carry-over
Come si può fare per non precipitare artefatti
Evidenze incrociate con altre tecniche
Se la proteina che coprecipita è già nota è più
facile dimostrare la sua identità con un
anticorpo specifico Inversione dellesperimento
col 2 ab si ripesca il 1enzima
Controlli con altri tipi di estratti e con
condizioni diverse
Stressare le condizioni di legame per eliminare
legami aspecifici
Per proteine nuove il rischio di vedere artefatti
è più difficile da controllare
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Imm.precipitazione con DNA o RNAin breve II
Immunoprecipitazione del DNA legato a fattori di
trascrizione
Anticorpo specifico (monoclonale, dovete sapere
cosa è)
Non deve alterare il sito di legame al
DNA homeo box zip domain zinc finger
Viene fissata la prot. al DNA precipitato e
amplificato
Si deve conoscere proteina (Ab) e sito di legame
(PCR) Verifica del legame in vitro o in vivo
CHIP chromosome immune-precipit.
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Iterferenza exp in cellule Hela
Cellule epiteliali di carcinoma umano della
cervice
Exp. trasfezione con siRNAs biotinilato co-immuno
precipitazione coprecipita compl.
enzimatico purificazione di 2 enzimi 100
kDa famiglia geni Argonauta (sviluppo Drosofila
Ago1 e Ago2 interaz. con metab. RNA)
Solo Ago 2 ha la capacità di taglio, gli altri
legano piccoli RNA
Topo transgenico per Ago2 non chiude il tubo
neurale
Attività Rnase, sito attivo con motivo DDE
(aspart. glutam.) Identico ad Ago2 - due domini
PIWI e PAZ sito PIWI taglia e PAZ lega mRNA
(slicer activity) Mutazioni al sito DDE non
tagliano
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Più attività e funzioni di un sistema complesso
Come viene scelta lelica del dsRNA da processare
? quale elica lega RISC/Ago2 ? lantisenso è
meno stabile
RISC avrebbe 2 attività come si libera la siRNA
dal dsRNA ?
Il complesso formato da Dicer-Ago2- siRNA con TRBP
Nuova evidenza che RISC è complessato ad rRNA
80S (controlla i messaggeri per la traduzione)
Negli oociti di Drosofila non cè traduzione e
nemmeno linterferenza funziona
Necessità di altro exp di conferma
prossima diapo
RISC RNA interference (gene)-silencing complex
TRBP HIV transactivating response RNA binding
protein
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Exp traduzione - interference
Sistema Iron ferro
Le proteine regolatrici del ferro IRPs in assenza
di ferro legano siti specifici di risposta al
ferro che stanno nei mRNA dei geni di controllo
Iron e bloccano la traduzione impedendo ai
fattori di inizio di legare lmRNA
Esperimento con reporter gene regolato con siti
Iron
Lattività RISC non richiede traduzione di
mRNA RNA-induced gene-silencing complex (RISC)
siRNAs contro il gene reporter era attivo sia in
presenza che assenza di ferro, indipendentemente
che lmRNA fosse tradotto o meno
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Vettore per dsRNA palindrome
In alternativa al primo vettore con GFP e lamina
A/C costitutivo
Vettori per il silenziamento di geni espressi con
metodo piu efficace di quello dellRNA
antisenso. Paddison et al. PNAS 5 Feb.
2002 Clonaggio con inserimento di elementi
fiancheggianti LoxP del fago P1 che tramite
lenzima CRE (ricombinasi) se gli elementi sono
in palindrome produce una inversione
dellinserto, se gli elementi sono in tandem fa
excidere ed integrare se ce un solo elemento
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funzione del vettore per interferenza
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Exp DICER GFP
(due negazioni affermano !)
Linterferenza contro la GFP viene bloccata
bloccando DICER con interferenza. Exp. very
elegant
P19 GFP Harpin
ds FF
ds Dicer
Cellule trasfettate con pGFP e dsRNA di DICER o
Firefly GFP Dimostrazione che è DICER a mediare
linterferenza
P19 EC cells cellule con il vettore stabilmente
integrato.
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2 modelli di interferenza
Modello 1
dicer
TRBP
Dicer taglia il ds RNA lungo in siRNA
Ago2
Ago2
TRBP
Formazione del complesso Ago2 TRBP
Corpi P di degradazione di mRNA
Ago2
3 finisce nei corpi P e Ago2 viene rilasciato
di nuovo
5 degradato da exonucleasi
Il lungo RNA a doppio filamento è degradato da
DICER che recluta Ago2 e TRBP. Ago2 taglia il
piccolo siRNA che poi si associa al mRNA, viene
tagliato in due frammenti, lexisoma digerisce il
frgm 5, il frgm 3 entra nel corpo P e la
degradazione con Xrn1 rilascia Ago2 che nel
citoplasma ricomincia il ciclo e si riassocia ad
un altro complesso mRNA
Xrn1 esonucleasi
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modello di interferenza n.2
mRNA si associa nei corpi P tramite RCK (elicase)
che permettono ad AGO2 e RISC di trovare il
bersaglio di ibridazione con il siRNA, dopo
libridazione con il bersaglio l mRNA è tagliato
ed i frammenti degradati allinterno del corpo P
Inibizione della traduzione tramite RCK
ribosoma
Il ribosoma si disassembla
Ago2
DICER e TRBP Digeriscono il dsRNA in siRNA
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approfondimento
PLoS Biol. 2006 Jun 134(7)e210 Epub ahead of
print Links Translation Repression in
Human Cells by MicroRNA-Induced Gene Silencing
Requires RCK/p54. Articolo disponibile o-l sulla
biblioteca bio-medica di TV Chu CY, Rana TM.
Department of Biochemistry and Molecular
Pharmacology, University of Massachusetts Medical
School, Worcester, Massachusetts, United States
of America. RNA interference is triggered by
double-stranded RNA that is processed into small
interfering RNAs (siRNAs) by Dicer enzyme.
Endogenously, RNA interference triggers are
created from small noncoding RNAs called
microRNAs (miRNAs). RNA-induced silencing
complexes (RISC) in human cells can be programmed
by exogenously introduced siRNA or endogenously
expressed miRNA. siRNA-programmed RISC (siRISC)
silences expression by cleaving a perfectly
complementary target mRNA, whereas miRNA-induced
silencing complexes (miRISC) inhibits translation
by binding imperfectly matched sequences in the
3' UTR of target mRNA. Both RISCs contain
Argonaute2 (Ago2), which catalyzes target mRNA
cleavage by siRISC and localizes to cytoplasmic
mRNA processing bodies (P-bodies). Here, we show
that RCK/p54, a DEAD box helicase, interacts with
argonaute proteins, Ago1 and Ago2, in
affinity-purified active siRISC or miRISC from
human cells directly interacts with Ago1 and
Ago2 in vivo, facilitates formation of P-bodies,
and is a general repressor of translation.
Disrupting P-bodies by depleting Lsm1 did not
affect RCK/p54 interactions with argonaute
proteins and its function in miRNA-mediated
translation repression. Depletion of RCK/p54
disrupted P-bodies and dispersed Ago2 throughout
the cytoplasm but did not significantly affect
siRNA-mediated RNA functions of RISC. Depleting
RCK/p54 released general, miRNA-induced, and
let-7-mediated translational repression.
Therefore, we propose that translation repression
is mediated by miRISC via RCK/p54 and its
specificity is dictated by the miRNA sequence
binding multiple copies of miRISC to
complementary 3' UTR sites in the target mRNA.
These studies also suggest that translation
suppression by miRISC does not require P-body
structures, and location of miRISC to P-bodies is
the consequence of translation repression.
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conclusioni
Resta da capire se è valido il modello n.1 o n.2

Potrebbe venir proposto un altro modello alla
luce di nuove evidenze che sconfessa quelli
precedenti
del doman non vè certezza L. da Vinci
 L. il Magnifico A.
Poliziano L. Pulci
?