Diapositiva 1

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TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
Perché manipolare i geni? 1) Per facilitare lo
studio dellespressione genica e della
regolazione fisiologica 2) per identificare il
prodotto di un gene e/o per ottenerne la
sovraespressione 3) per studiare la relazione
fra struttura e funzione delle proteine 4) per
identificare componenti cellulari che
interagiscono con particolari sequenze di acidi
nucleici o con particolari domini proteici
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PROCEDURA di CLONAGGIO
ISOLAMENTO del gene INSERZIONE del gene in un
VETTORE PLASMIDICO INTRODUZIONE del vettore
plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo
Le fasi più delicate sono quelle del taglio e
dellunione di sequenze di DNA in modo
preciso. ..tutto ciò si ottiene con lausilio
di ENZIMI
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Cosa serve per un clonaggio

• Gene (DNA di interesse)
• Enzimi di restrizione
• DNA ligasi
• Vettore
• Cellula ospite

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DNA LIGASI
Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5
di una estremità ed il gruppo ossidrilico 3
della catena adiacente.
Lenzima comunemente utilizzato è la T4 DNA
Ligasi perché stabile e poco costosa.
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DNA LIGASI
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Vettori di clonaggio

• Plasmidi
• Fagi
• Cosmidi
• Yac
• Bac

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PLASMIDI
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE Inserime
nto del plasmide nella cellula ospite Cellule
competenti
Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide
formeranno delle colonie.
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Curva di crescita di E. coli
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PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
LISI ALCALINA
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...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita di
CsCl in presenza di EtBr
Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico
dallintercalazione del bromuro detidio fra le
basi ne impedisce progressivamente il legame
rendendo la densità idrodinamica del DNA
plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.
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(No Transcript)
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Riepilogo di un procedimento di clonaggio
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Libreria genomica
Quando si clona lintero genoma di un organismo
si dice che si costruisce una libreria (library)
genomica
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Libreria di cDNA (DNA complementare)
La miscela di frammenti che contiene tutte le
sequenze codificanti costituisce la libreria di
cDNA.
1-Estrazione di mRNA
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2-Sintesi del cDNA (1 metodo)
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Sintesi del cDNA (2 metodo)
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• genoma di 1.85 x 108 bp
• dopo digestione, abbiamo avuto frammenti di
  circa 20.000 basi che possiamo clonare nel
  vettore opportuno.
• Se ogni tratto del genoma fosse presente una sola
  volta, basterebbero 10.000 cloni per
  rappresentare tutto il genoma.
• Esiste una formula che permette di calcolare il
  numero dei cloni necessari per avere un alta
  probabilità che tutti frammenti siano
  rappresentati
• n ln(1-p)/ln(1-f)
• f 20.000 bp/185.000.000 circa 10-4 cioè ogni
  inserto di 20 kb è 1/10.000 del genoma totale.
• La probabilità p può essere scelta come 95, 99,
  99.9 a seconda della sicurezza che si desidera
  avere.
• Nei tre casi il numero dei cloni sarà
• 30.000, 4-50.000, 70.000

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SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA
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(No Transcript)
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SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
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Altri vettori di clonaggio

• Fagi
• Cosmidi
• Yac (yeast artificial chromosome)
• BAC

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• I fagi (o batteriofagi) sono strutture biologiche
  complesse in grado di fissarsi alla parete
  batterica e quindi introdurre il loro DNA
  all'interno del batterio. (trasfezione) . Il fago
  più usato e conosciuto è il fago lambda.
• Il fago l è un fago temperato, ha un peso
  molecolare di 31.106 Da ed è lungo 48.502 bp

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• Il DNA isolato da alcune particelle virali è a
  doppio strand con due estremità a singolo
  filamento di 12 nucletotidi complementari fra
  loro, chiamati siti cos. Questi siti permettono
  al DNA di circolarizzare dopo linfezione della
  cellula ospite.
• 5 GGGCGGCGACCTCGC---------------------- ACG 3
• GCG---------------------TCGCCCGCCGCTGG
• La mappa genetica del fago l comprende circa 40
  geni che possono essere suddivisi in tre gruppi
  funzionali
• la parte sinistra, comprendente i geni da A a J,
  codifica per proteine strutturali della testa e
  della coda.
• la parte centrale, contiene geni responsabili per
  la lisogenia, cioé il processo che porta
  all'integrazione del DNA virale ed altri processi
  ricombinativi. Gran parte di questa regione non é
  essenziale per la crescita litica e può essere
  eliminata per la costruzione di vettori.
• la parte destra contiene geni coinvolti nella
  replicazione del DNA e nel ciclo litico (S, R),
  geni regolatori (cI, cII, cIII, cro, N, Q) (Fig.
  33)

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(No Transcript)
28
(No Transcript)
29
CICLO LISOGENICO Ad alto stato di infezione la
cellula contiene alte concentrazioni di
cIII Hfl è inibita cII stimola la trascrizione
di cI e la proteina Integrasi cI è un
repressore dei geni del ciclo litico e blocca la
sintesi di N, O, P e Q legandosi agli operatori
OL e OR, bloccando il ciclo litico CICLO
LITICO A basse concentrazioni di cIII Hfl non
inibita riduce lattività o la quantità di
cII blocco della sintesi di cI la sintesi di N,
O, P, Q non è più bloccata
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(No Transcript)
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• La regione tra i geni J e N del genoma di l non è
  essenziale per la crescita litica. In linea di
  principio, un vettore privo di questa regione
  potrebbe contenere circa 14.500 bp di DNA
  estraneo
• Nella testa del fago può trovare posto fino al
  105 della lunghezza del suo DNA e, inoltre,
  esistono nei bracci di l altre regioni non
  essenziali che possono essere rimosse.
• Considerando tutto questo si ottiene un valore
  massimo di circa 22 Kb di DNA estraneo
  inseribile.
• Esiste anche un limite inferiore, pari al 75 del
  genoma di l, pari a circa 37 Kb, al di sotto il
  DNA non viene impaccato e il l non è vitale.
• Esistono due tipi di vettori l
• I vettori d'inserzione
• I vettori di sostituzione

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(No Transcript)
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DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO
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IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE
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COSMIDI
Sono PLASMIDI, ma contengono, oltre alle
caratteristiche essenziali di un plasmide, anche
un SITO COS
La presenza di questo elemento è determinante per
consentire linserimento della molecola di DNA
ricombinante nella testa del virus che, a sua
volta, la inietta in una cellula batterica per
infezione.
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c) cosmidi
Sono plasmidi che utilizzano la capacità del
batteriofago lambda di impacchettare lunghi
frammenti di DNA lineare allinterno del capside,
di aderire alla superficie delle cellule
batteriche e di iniettare il loro contenuto
allinterno del batterio. Rispetto al
batteriofago lambda, può contenere un inserto di
DNA di dimensioni maggiori (45 kb). Il cosmide
circolarizza e si comporta come un grande
plasmide replicando il proprio genoma.
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(No Transcript)
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d) Vettori BAC
Bacterial Artificial Chromosome Plasmidi di
dimensioni enormi, consentono linserimento di
frammenti di DNA umano fino a 300 Kb. Il DNA
viene inserito nei batteri mediante processo di
elettroporazione uno shock elettrico provoca la
formazione transitoria di pori sulla membrana
batterica attraverso i quali passa il DNA.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Ospiti per i vettori

• Le caratteristiche di un ospite di clonaggo sono
• crescita rapida
• capacità di crescere in terreni di coltura poco
  costosi
• non patogencità
• capacità di essere trasformato
• stabilità della coltura.

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Curva di crescita di E. coli
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)