Determinazione della fase

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Determinazione della fase

• Cristallografia delle piccole molecole
  Metodi diretti
• Metodo della Sostituzione Isomorfa
• Molecole Grandi (Proteine) (Sostituzione
  Isomorfa Multipla MIR, multiple
  isomorphous replacement).
• MIR Introduzione di nuovi centri di scattering
  nella cella elementare
• costituiti da atomi pesanti (in modo che essi
  contribuiscano significativamente alla
  diffrazione)
• in numero limitato (per localizzarne la
  posizione)
• non dovrebbero cambiare le caratteristiche
  strutturali della molecola e della cella
  (cristalli isomorfi).
• In pratica la MIR si ottiene facendo diffondere
  diversi complessi di metalli pesanti nei canali
  dei cristalli preformati. Se le catene espongono
  gruppi SH, essi legheranno i metalli. Nelle
  metallo-proteine i metalli leggeri possono essere
  sostituiti con metalli più pesanti (es. Zn-Hg,
  Ca-Sm).

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Determinazione della fase

• I metalli pesanti contengono molti più elettroni
  degli atomi leggeri (H,N,O,C,S) della proteina,
  diffondono i RX più intensamente. Dopo una MIR se
  tutte le interferenze fossero positive tutti i
  raggi diffratti aumenterebbero di intensità. Ma
  alcune interferenze sono negative, per cui dopo
  la MIR, alcuni spot aumentano di intensità, altri
  diminuiscono ed altri non variano. Dalle
  differenze di intensità prima e dopo la MIR, si
  possono dedurre le posizioni degli atomi pesanti
  nel cristallo. Le trasformate di Fourier di
  queste diff. di intensità forniscono le mappe dei
  vettori tra gli atomi pesanti (mappe di
  Patterson). Dalle mappe di Patterson si possono
  dedurre le posizioni degli atomi pesanti nella
  cella elementare, per cui da queste le ampiezze e
  le fasi e dal loro contributo ai raggi diffratti
  dal cristallo.

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Determinazione della fase

• Conoscendo
• Ampiezza e fase atomi pesanti
• Ampiezza proteina
• Ampiezza proteina-metalli pesanti
• si può calcolare se linterferenza dei RX
  diffusi dai metalli pesanti e dalla proteina è
  costruttiva o distruttiva. Una stima della fase
  della proteina si può ottenere dallentità
  dellinterferenza con le informazioni sulla fase
  del metallo.
• Sono però possibili due differenti angoli di
  fase, per distinguere tra le soluzioni possibili
  è necessario avere un complesso con un secondo
  atomo pesante che darà altri due angoli di fase
  possibili per la proteina. Quello che avrà lo
  stesso valore di uno degli angoli di fase
  determinati nel caso precedente sarà langolo di
  fase corretto.
• In pratica si devono preparare più di due
  complessi proteina-metallo pesante per ottenere
  una fase buona per tutte le riflessioni.
• Le ampiezze e le fasi dei dati ottenuti vengono
  impiegati per calcolare le mappe di densità
  elettronica dellunità ripetitiva del cristallo.

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(No Transcript)
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Costruzione del modello

• La mappa di densità elettronica va interpretata
  in termini di catena peptidica (sequenza aa). Vi
  sono però limiti dei dati
• imprecisioni da errori negli angoli di fase
• risoluzione dei dati che dipende dallordine nei
  cristalli (misurata in A, minore è il suo valore
  più elevata è la risoluzione e quindi la quantità
  di dettagli che si possono osservare).
• Bassa risoluzione (gt5) forma della molecola,
  regioni a elica come cilindri
• Media risoluzione (ca.3) percorso della catena
  e fitting sequenza aa
• Alta risoluzione ca.2 si discrimina tra
  catene laterali molto simili ca.1 atomi
  come sfere di densità elettronica
• La costruzione del modello iniziale è un
  processo di prova/errore. Occorre
• decidere in che modo la catena polipetidica
  traccia il suo percorso nella densità elettronica
• si tenta di adattare in base allipotesi la
  densità delle catene laterali della sequenza nota
  del polipetide
• Utilizzo computer grafica

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Costruzione del modello

• La mappa di densità elettronica viene
  rappresentata sullo schermo del computer
  (computer grafica) in combinazione con una parte
  della catena polipeptidica.
• La mappa di densità elettronica ottenuta viene
  interpretata adattandovi parti della catena
  polipeptidica con stechiometria nota (backbone e
  catene laterali).
• Le unità della catena polipeptidica vengono
  ruotate e traslate rispetto alla densità
  elettronica fino a che si ottiene una buona
  corrispondenza tra le due.
• Utilizzo mappa Fourier differenza (sia per
  aggiustare modello che per risolvere nuove
  strutture).

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Costruzione del modello R-factor

• Il modello viene via via corretto mediante
  affinamento, per cui esso viene modificato
  minimizzando la differenza tra ampiezze osservate
  sperimentalmente e quelle calcolate per un
  ipotetico cristallo contenente il modello invece
  della molecola reale (minimi quadrati).
• Questa differenza viene espressa come R-factor
  che rappresenta la discordanza residua (R0 per
  un accordo esatto, 0.59 per disaccordo totale).
• Per una struttura proteica ben determinata R è
  compreso tra 0.15 e 0.20.

• La diff. residua (ad alta risoluzione) non è
  dovuta a grossi errori nel modello, ma a errori e
  inesattezze nei dati che derivano principalmente
  da
• Piccole variazioni nelle conformazione delle
  molecole proteiche
• Correzioni inadeguate presenza solvente
• Differenze orientamento microcristalli che
  formano il cristallo.
• Il modello finale è media delle molecole
  (leggermente diverse in conformazione e
  orientamento) presenti nel cristallo, per cui il
  modello non corrisponde mai in modo esatto al
  cristallo reale.
• La conoscenza della sequenza aa (da sequenza
  nucleotica nelle tecniche DNA ricmbinante per la
  produzione della proteina stessa) è
  indispensabile per la determinazione della
  struttura a RX. Le strutture determinate possono
  identificare errori nella determinazione della
  sequenza.

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Determinazione struttura proteine
Cristallo
Densità elettronica r (x,y,z)
Data Collection F, (hkl)
Fasi a(hkl)
Struttura
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GMER
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Actina