Studio della metabolismo ossidativo della Dopamina

1
Studio della metabolismo ossidativo della Dopamina
2
Neuromelanin formation
3
LOCALIZZAZIONE ATTIVITA DOPAMINO PEROSSIDASICA
IN CERVELLO DI RATTO
E UMANO



4
Studio in vitro della formazione del dopaminocromo

• La formazione di dopaminocromo è catalizzata in
  maniera simile da perossidasi purificate
  (lattoperossidasi, mieloperossidasi, perossidasi
  di rafano) e da una frazione di cervello di
  ratto, in presenza di perossido didrogeno.
• La formazione di un intermedio radicalico,
  dopamino-o-semichinone, è comune nelle reazioni
  catalizzate da ciascuna delle perossidasi e dalla
  frazione di cervello di ratto. (Galzigna et al.
  Biochim Biophys Acta 1999)

5
Procedures
Preparation of protein mixture
The midbrain fractions were homogenized and
centrifuged. The supernatant, obtained after two
successive centrifugations, was
spectrophotometrically assayed for enzymatic
activity.
striato
s.nigra
Assay of peroxidizing activity
Dopamine peroxidizing activity was in vitro
followed spectrophometrically, as increasing
absorbance at 475nm, corresponding to the peak of
maximum absorption of the dopaminochrome formed
from dopamine and hydrogen peroxyde.
6
Come si determina lattività enzimatica

• Attività enzimatica
• ?A475 rappresenta la variazione di assorbanza
  misurata a 475 nm
• e è il coefficiente di estinzione molare del
  substrato cromoforo 1175 M-1cm-1
• La determinazione è stata effettuata in un il
  volume totale della miscela (omogenato e tampone
  di lettura) di 10-3 L (Galzigna et al., 1999)

7
ATTIVITA DOPAMINO PEROSSIDASICA IN MESENCEFALO E
GANGLI DELLA BASE DA REPERTI AUTOPTICI
PARKINSONIANI E CONTROLLI
Attività dopamino perossidasica in
mesencefalo Controlli (media dei valori) 249
(SD/-191) mmol dopaminocromo/min/mg proteina PD
(media dei valori) 789 (SD/-149)
mmol dopaminocromo/min/mg proteina Attività
dopamino perossidasica nei gangli della
base Controlli (media dei valori) 0 mmol
dopaminocromo/min/mg proteina PD (media dei
valori) 529 mmol dopaminocromo/min/mg
proteina  
  Significativamente differente dai
controlli, plt0,001 con t di Student  
 
8
CONCENTRAZIONE DELLE CATECOLAMINE IN MESENCEFALO
E GANGLI DELLA BASE
Cconcentrazione della dopamina nel
mesencefalo Ccontrolli (media dei valori) 62
nmol/L (SD/-37) PD (media dei valori)
31 nmol/L (SD/-26)   Cconcentrazione della
dopamina nei gangli della base Ccontrolli (media
dei valori) 59 nmol/L (SD/-35) PD (media
dei valori) 43 nmol/L (SD/-22)
Significativamente differenti dal controllo
plt 0.05 con t di Student.  
9
PROCEDURE ELETTROFORETICHE
10
Procedure elettroforetiche

• Gel di poliacrilamide non denaturante è
  utilizzato per il frazionamento di miscele
  proteiche che mantengono la loro conformazione
  nativa.
• Esso non permette di distinguere gli effetti
  delle dimensioni, della struttura e della carica
  elettrica netta di ciascuna proteina sulla
  mobilità elettroforetica.
• E utilizzato soprattutto quando si voglia
  studiare lattività biologica di una proteina.

11
Procedure elettroforetiche

• Gel di poliacrilamide denaturante in presenza di
  sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE).
• Prevede la denaturazione delle miscele proteiche
  al calore e il trattamento con agenti riducenti
  (2-a-mercaptoetanolo), che rompe i ponti
  disolfuri intra ed intercatena, causando lo
  srotolamento della struttura ripiegata della
  catena. La presenza dellSDS assicura prolungata
  denaturazione, rompendo i legami covalenti, e,
  avvolgendo la proteina, le conferisce carica
  negativa, indipendentemente dalla sua carica
  netta.
• Tutte le proteine della miscela migrano verso
  lanodo, risolte in bande discrete, con una
  velocità inversamente proporzionale al logaritmo
  del loro peso molecolare.
• Si attribuisce peso molecolare alle bande
  discrete mediante confronto della loro mobilità
  elettroforetica con quella di alcune proteine a
  peso molecolare noto

12
Protein mixtures of midbrain tissues homogenates
from four different specimens were separated by
non-denaturing polyacrylamide gel
electrophoresis, in two corresponding gel sets
The protein mixtures were separated along with
horse radish peroxidase, which was present as
peroxidatic actvity control. After
electrophoresis running, one gel set was stained
with the substrate solution (2mM DA, 30mM H2O2)
and the second control gel set was stained with
Coomassie Blue.
Separation of protein mixture
Q-mass spectrometry analysis

• A red/orange band diplaying peroxidatic
  activity and the corresponding band stained with
  Coomassie Blue were analysed by mass spectrometry.

13

• 
  
  
  
  
  
  
  

DOPAMINE PEROXIDIZING ACTIVITY DETECTION ON
NON-DENATURING POLYACRYLAMIDE GEL




A
A
A
1 2 3 4 HRP
1 2 3 4 HRP
1 2 3 4 HRP
14
(No Transcript)
15
Proteins identified in colorless,
non-reactive band
Protein ID Protein name Molecular Weight Peptide identification
1 IPI00291005 Malate dehydrogenase, cytoplasmic 36426 7
2 IPI00019901 Isoform 1 of Alpha-adducin 80955 8
3 IPI00218914 Retinal dehydrogenase- 1 54862 11
4 IPI00419424 IGKV1-5 protein 26234 18
16
Conclusions

• We have developed a method for detecting on
  native gel a dopamine peroxidizing activity from
  human midbrain.

• This method appears to be the first report of a
  peroxidatic activity in gel detection using
  dopamine and hydrogen peroxide as substrates.

• Q-mass spectrometry analysis of the activity
  bands revealed the presence, among the others, of
  two proteins macrophage migration inhibitory
  factor (MIF) and Peroxiredoxin-1, highlighting
  a possible functional link among
  dopamine/dopaminochrome redox cycle and protein
  metabolism.

17
PERSPECTIVES

• Our findings, revealing a possible functional
  link among oxidative species and protein
  metabolism, are consistent with the latest
  studies on the pathogenic mechanism of PD.
• The properties of MIF and Peroxiredoxin-1 present
  in the activity bands are consistent with their
  role in the maintenance of redox potential within
  cells.
• New experimental approaches are under study in
  order to define the role of proteins found in the
  gel activity band, in particular of MIF and
  Peroxiredoxin-1, in oxidative metabolism of
  dopamine and in PD.

18
Cosè la PROTEOMICA ?

• La proteomica è una disciplina scientifica
• che permette lo studio del PROTEOMA,
• cioè delle PROTeine espresse da un
• genOMA in una particolare cellula,
• tessuto o organismo, sia esso animale o
• vegetale

19
(No Transcript)
20
(No Transcript)
21
Cosè la SPETTROMETRIA DI MASSA

• Euna tecnica analitica che permette di
  determinare la massa molecolare di un composto
  chimico.
• Ha origine nella prima metà del 1900, grazie agli
  studi di J. Thompson, il quale osservò che, in un
  tubo sotto vuoto a cui venga applicata una
  differenza di potenziale, si formano elettroni e
  radiazioni positive.
• Uno spettrometro di massa è uno strumento che
  misura la massa molecolare di una molecola, dopo
  che gli sia stata impartita una carica elettrica.
  Esso è, infatti, in grado di separare gli ioni
  molecolari in base al loro rapporto massa/carica.

22
MALDI
MALDI-Tof
MALDI, matrix.assisted laser desorption/ionizatio
n desorbimento è un processo in cui una miscela
viene evaporata da una superficie e ionizzata.
Piastra maldi è un supporto dacciaio il
campione dopo dogestione con tripsina e immerso
in una matrice (acido organico) che funziona da
solvente eminimizza le interazioni molecolari,
assorbe parte dellenergia che viene impartita,
ed ha un ruolo attivo anche nella formazione
dellevaporazione e formazione degli ioni per
protonazione, cioè assorbono una carica positiva.
Il campione depositatato sulla piastra viene
lasciato cristalllizzare e bombardata con fotoni
ad alta energia, proveneienti da raggio laser
pulsato, quinid vengiono diretti verso
lanalizzatore tof, che è un tubo, di lunghezza
notain cui viene fatto il vuoto. Gli ioni
vengono emessi ad unenergia cinetica costante ed
indirizzati verso il tubo. E i\e mv2, dove m è
la massa dello ione e v la sua velocità. Minore
sarà il rapporo massa\carica maggiore sarà la sua
velocità.
23
Spettrometria di massa
24

• Fragment fingerprinting del peptide selezionato
  la sequenza parziale, insieme con la massa,
  costituisce un tag di sequenza che può essere
  utilizzato come probe, altamente specifico, per
  identificare proteine nei database proteici.
• Lo spettro di frammentazione può anche essere
  analizzato automaticamente per mezzo di SEQUEST,
  un programma che consente la correlazione dei
  dati sperimentali con spettri teorici, generati
  da sequenze proteiche note presenti nei database.

25
Procedure elettroforetiche

• L elettroforesi BIDIMENSIONALE prevede due fasi
• IEF Separazione delle proteine in base alle
  differenze nella loro carica netta mediante
  lisoelettrofocalizzazione
• SDS-PAGE Separazione delle proteine focalizzate
  in base alla loro massa molecolare, in gel
  denaturante

26
Modello di ratto emiparkinsoniano

La somministrazione di 6-OHDA riproduce, nel
ratto, fenomeni di stress ossidativo determinati
dalla riduzione dei complessi I e IV della catena
respiratoria con uniperproduzione mitocondriale
di radicali liberi, quali lo ione superossido, di
radicali idrossilici e di perossido didrogeno.
Questa riduzione dellattività dei complessi I e
IV mitocondriali è probabilmente alla base della
perdita di neuroni che si realizza, a livello
della substantia nigra trattata, nel giro di due
settimane. (A e B).
A denervazione dello striato ipsolaterale B
danno neuronale in s.nigra, dopo iniezione di
6-idrossidopamina (6-OHDA)
27
CONCLUSIONI

• IL protocollo di estrazione e solubilizzazione
  delle proteine, messo a punto per il tessuto
  cerebrale, associato ad un programma mirato di
  isoelettrofocalizzazione, ci ha permesso di
  ottenere una soddisfacente risoluzione del
  corredo proteico delle sezioni di substantia
  nigra e di striato mediante separazione in doppia
  dimensione.
• Significative variazioni di espressione di alcune
  proteine sono emerse dal confronto, effettuato
  mediante software dimmagine, dei profili
  proteici delle sezioni di tessuto neurodegenerato
  rispetto al controllo. Le proteine, individuate
  come significativamente differenti nei tessuti
  patologici rispetto ai controlli, sono state
  sequenziate in spettrometria di massa MALDI-TOF.
• Nel campione di tessuto ottenuto dallo striato
  due spot che appaiono piu intensamente espressi
  nel profilo proteico dello striato indotto alla
  neurodegenerazione, rispetto al controllo,
  corrispondono alla b-actina.
• Lo spot proteico presente nel campione di
  substantia nigra trattato con 6-OHDA e non nel
  rispettivo controllo corrisponde ad unenzima
  la-enolasi ( 2-fosfo-D-glicerato idrolasi) (non
  neuronal-enolasi) (NNE).
• L aumento dei livelli di espressione
  della-enolasi e della b-actina, nei tessuti
  neurodegenerati rispetto al tessuto di controllo,
  potrebbe essere risultato dei fenomeni di
  ossidazione indotti dalla 6-OHDA. Entrambe le
  proteine appaiono coinvolte nei processi di
  neurodegenerazione ed è testimoniata
  lossidazione che esse subiscono nella malattia
  di Alzheimer. ( Castagna et al.,2002).
• Il coinvolgimento di fenomeni di stress
  ossidativo nella patogenesi del morbo di
  Parkinson è infatti largamente dimostrato (Jenner
  et al. AnnNeurol, 2003 53 suppl. S26-S38). I
  nostri risultati sono pertanto ricollocabili
  allinterno di tale scenario. Se la-enolasi e la
  b-actina possono essere considerate bersagli del
  processo di ossidazione che avviene a carico di
  molteplici proteine, nelle malattie
  neurodegenerative quali il morbo di Parkinson e
  la malattia dAlzheimer, potrebbero
  rappresentare importanti indicatori diagnostici,
  sebbene occorra stabilire in quale fase della
  malattia insorgano le alterazioni osservate, per
  far luce sul fattore o i fattori dinnesco della
  neurodegenerazione. Solo in questo modo, infatti,
  sarà possibile risolvere il nesso di causalità
  della malattia, ancora purtroppo oscuro.

28
DOPAMINA
29
6-IDROSSIDOPAMINA
30
Confronto tra i profili proteici ottenuti da
sezioni di tessuto
b-actina
A Neostriato controllo Neostriato
trattato con 6-OHDA
a-enolasi
B S. nigra controllo S. nigra
trattata con 6-OHDA
31
Separazione miscela proteica di substantia nigra
di ratto emiparkinsoniano mediante elettroforesi
bidimensionale
32
(No Transcript)