Chimica Fisica Biologica Determinazione della struttura delle proteine

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Chimica Fisica BiologicaDeterminazione della
struttura delle proteine
Gaetano M.M. Izzo
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Introduzione

• Per lo studio della struttura di molecole
  proteiche vengono utilizzate diverse tecniche
• Metodi Biochimici
• Struttura Primaria (determinazione
  diretta della sequenza aa o indirettamente
  dalla sequenza nucleotidica del
  gene)
• Struttura Quaternaria Microscopia Elettron.
• di grosse proteine (informazioni con
• o aggregati (virus, risoluzioni molto
  basse o
• ribosomi, etc.) prive di
  dettagli, in alcuni
• casi il percorso della catena
  polipeptidica)

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• La determinazione della struttura secondaria e
  terziaria richiede una informazione dettagliata
  sulla disposizione degli atomi in una proteina.
• Le strutture proteiche a livello di struttura
  secondaria e terziaria vengono determinate
  mediante metodi fisici di cui i principali sono
• Cristallografia a RX
• Metodi NMR
• La maggior parte delle strutture proteiche viene
  determinata mediante cristallografia a raggi X,
  mentre sono stati sviluppati metodi NMR per
  ottenere modelli tridimensionali di piccole
  molecole proteiche (informazioni sulle distanze
  tra gli atomi, NMR bidimensionale, spettri COSY e
  NOE).

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Cristallografia a Raggi X

• La diffrazione di RX (o cristallografia RX) è la
  principale tecnica di determinazione strutturale
  per le proteine (80 strutture proteiche presenti
  in PDB, 95 di quelle con più di 80aa).
• Principio fisico Scattering dei RX da parte
  degli elettroni
• Richiede la disponibilità di cristalli.
• Permette di avere una risoluzione atomica.
• Si possono studiare proteine con PM fino a
  ca.10000KDa
• Applicazioni piccole molecole, proteine,
  virus, ribosomi

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Cristallografia RX di proteine

• Cristallizzazione
• Raccolta dati
• Risoluzione, affinamento e analisi strutturale
  (determinazione della fase e model building).

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Cristalli di proteine - Caratteristiche

• La cristallizzazione di una proteina è
  generalmente difficile, la crescita dei cristalli
  può essere molto lenta ed ottenere cristalli
  sufficientemente grandi (gt0.5mm) può richiedere
  diversi mesi.
• Ciò che rende i cristalli proteici diversi da
  quelli di una piccola molecola è il contenuto in
  solvente nei cristalli delle molecole tutti gli
  atomi possono essere descritti in termini di
  reticolo regolare, mentre per i cristalli
  proteici un reticolo cristallino coesiste con un
  elevata quantità di materia allo stato liquido.
  La soluzione madre, il cui contenuto nel
  cristallo può variare ca. dal 30 all80, ha una
  forte influenza sul comportamento dei cristalli
  stessi determinandone pregi e difetti
  caratteristici tra cui il principale è il fatto
  che i cristalli proteici sono molto meno ordinati
  dei cristalli classici, sia per lelevato
  contenuto di materiale disordinato presente
  allinterno del cristallo, ma anche perché i
  gruppi sulla superficie della macromolecola in
  contatto con il solvente possono avere una forte
  mobilità.

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Cristalli di proteine - Caratteristiche

• Per questo motivo, i dati di diffrazione non
  possono essere misurati con la risoluzione che
  normalmente si può ottenere con le piccole
  molecole.
• Daltra parte, però, lambiente in cui si trova
  la macromolecola nel cristallo non è molto
  diverso da quello della soluzione da cui è stato
  ottenuto (non va sottovalutata linfluenza del
  solvente sulla conformazione della proteina) e si
  può trarre vantaggio dalla presenza di solvente
  per la preparazione di derivati di atomi pesanti
  della proteina (MIR). I cristalli proteici sono
  quindi molto fragili e morbidi.
• Inoltre, nei cristalli proteici non sono
  permessi gli elementi di simmetria che implicano
  inversione, per cui il numero di possibili gruppi
  spaziali scende da 230 a 65.

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Cristallizzazione

• Il processo di cristallizzazione di una
  macromolecola è molto complesso ed una
  spiegazione teorica di tutti i suoi aspetti è
  impossibile. Tuttavia dallesperienza su di un
  elevato numero di proteine idrosolubili
  cristallizzate e con la disponibilità di una
  quantità di proteina sufficiente e ad elevata
  purezza, si hanno buone probabilità di ottenere
  cristalli utilizzabili per i RX.
• Molto più complessa la situazione per le
  proteine di membrana.
• La crescita di cristalli proteici avviene da una
  soluzione soprasatura della macromolecola
  attraverso uno stato termodinamicamente stabile
  nel quale la proteina è distribuita tra una fase
  solida e la soluzione. Il tempo necessario per
  raggiungere questo equilibrio ha una forte
  influenza sul risultato finale che può andare da
  un precipitato amorfo o microcristallino a grandi
  cristalli singoli. Le condizioni di
  soprasaturazione possono essere ottenute
  aggiungendo agenti precipitanti o modificando
  alcuni parametri interni alla soluzione come pH e
  T. Vanno tuttavia evitate le condizioni estreme
  poiché la proteina e una molecola labile.
• Per comprendere meglio le proprietà biologiche e
  fisiologiche della macromolecola attraverso la
  determinazione della struttura 3D è molto meglio
  crescere i cristalli in condizioni non troppo
  lontane da quelle fisiologiche in cui la molecola
  svolge la sua attività.
• Per studiare il processo di cristallizzazione si
  può far riferimento ai diagrammi di fase.

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Cristallizzazione Diagrammi di fase

• La solubilità di una proteina può essere
  rappresentata con un diagramma di fase (Curva di
  solubilità della proteina).
• Asse orizzontale parametro che viene variato (di
  solito la conc. di precipitante)
• Asse verticale Conc. proteina.
• La saturazione si ottiene quando la velocità con
  cui la proteina passa nella fase solida è uguale
  a quella
• con cui passa in soluzione ed
• il sistema è allequilibrio.
• Salting-out sulla destra del diagramma
• dove la solubilità della proteina diminuisce
• con laumento della conc. salina.
• Salting-in sulla sinistra del diagramma
• dove la solubilità della proteina aumenta
• allaumentare dela conc. del sale.

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• Come può diventare soprasatura una soluzione
  proteica? Perché la proteina non precipita
  immediatamente appena si raggiunge la saturazione
  della soluzione?
• Perché per permettere ad una proteina di
  cristallizzare deve essere superata una barriera
  energetica analoga a quella delle reazioni
  chimiche.
• Esiste una barriera energetica da superare per la
  cristallizzazione
• Il nucleo critico di cristallizzazione
  corrisponde allintermedio.
• Più elevata è la barriera energetica, minore è la
  velocità di nucleazione.

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• La probabilità di nucleazione aumenta
  allaumentare della soprasaturazione
• Piu soprasatura è la soluzione proteica,
  maggiore è la probabilità che si formi un centro
  di nucleazione e minore sarà il numero di nuclei
  necessari per indurre la formazione di un
  cristallo.
• Tutto ciò si può rappresentare su un diagramma
  di fase suddividendo la zona di soprasaturazione
  in diverse regioni di probabilità crescente di
  nucleazione e precipitazione.

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Cristallizzazione Agenti precipitanti

• I precipitanti comunemente utilizzati possono
  essere suddivisi in 3 categorie
• Sali (inorganici AS, Na2SO4, NaCl, KCl, NH4Cl,
  MgSO4, CaCl2, NH4NO3, LiCl, etc. organici
  Citrato, Acetato, Formiato, etc.)
• Solventi organici (EtOH, Isopropanolo, Acetone,
  Diossano, 2-metil-2,4-pentandiolo (MPD), etc.)
• PEG ( da 200 a 20K e PEG MME).

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Cristallizzazione Fattori che la influenzano

• Parametri che influenzano la cristallizzazione
• pH il suo valore ha forte influenza sulla
  solubilità, la quale ha un minimo a pH vicini al
  punto isoelettrico della mm.
• Conc. Salina La forza ionica può avere effetti
  opposti sulla solubilità della proteina, ad
  esempio la solubilità diminuisce allaumentare
  della forza ionica (salting-out), ma ha anche un
  minimo a forza ionica molto bassa (salting-in).
  In pratica si può avere precipitazione aumentando
  la conc. Salina o dializzando la soluzione di
  proteina contro acqua.
• Solventi organici Le loro proprietà di
  precipitazione sono dovute al doppio effetto di
  sottrarre molecole dacqua dalla soluzione e dal
  diminuire la costante dielettrica del mezzo. Essi
  però possono avere anche effetti sulla
  conformazione della proteina e vanno quindi
  utilizzati con cautela.
• PEG e un agente precipitante con proprietà
  peculiari è un polimero, il suo effetto sulla
  solubilità è dovuto alla proprietà del volume di
  esclusione il solvente viene ristrutturato e di
  conseguenza viene promossa la separazione di
  fase.
• Molti altri parametri possono influenzare il
  processo di cristallizzazione la conc. di
  proteina, la temperatura, la presenza di cationi
  che a volte stabilizzano la conformazione della
  proteina, la purezza del campione. La presenza di
  contaminanti può essere molto importante
  nellimpedire la formazione di cristalli adatti
  allanalisi ai RX.

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Cristallizzazione - Metodi

• Esistono diversi metodi per cristallizzare le
  proteine, i più usati sfruttano lequilibrio in
  fase vapore e la dialisi
• Metodi di diffusione di vapore
• Tecniche di dialisi
• La crescita dei cristalli e la nucleazione non
  dipendono solo dai parametri visti, ma anche dal
  metodo utilizzato. Si usano incubatori termici
  per mantenere la T costante.

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Cristallizzazione Metodi di Diffusione di Vapore
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Cristallizzazione - Diffusione di vapore

• Hanging drop (goccia sospesa)
• Sitting drop
• (goccia seduta)
• Sandwich drop

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Cristallizzazione - Diffusione di vapore

• In un esperimento di vapour diffusion uguali
  volumi (non sempre) vengono miscelati in una
  goccia, la conc. di proteina e la conc. di
  precipitante raddoppieranno.
• Quando i cristalli iniziano a crescere, la conc.
  di proteina in soluzione diminuisce e si ha
  quindi la crescita dei cristalli.

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Setting esperimenti di cristallizzazione
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Cristallizzazione - Dialisi

• Microdialisi Set up di un esperimento con un
  bottone di dialisi.

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Cristallizzazione - Dialisi

• In un esperimento di cristallizzazione per
  dialisi la conc. di proteina è costante (se lo
  stiramento della membrana è trascurabile e la
  soluzione iniziale riempie completamente la
  camera di dialisi). In un esperimento salting-out
  la conc. di precipitante aumenta.
• La dialisi può essere utilizzata anche nella
  regione del salting-in del diagramma di fase
  forzando la proteina a uscire dalla soluzione
  diminuendo la conc. di precipitante (desalting).

Nella dialisi si ha il vantaggio di poter
cambiare la conc. di precipitante nel corso
dellesperimento. Si può anche aumentare la conc.
di un precipitante mentre si diminuisce la conc.
di un altro. Cambiamento di tampone.
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Cristalli proteici
Poiché in un cristallo proteico vi sono poche
interazioni dirette di impaccamento tra le
molecole di proteina, piccole variazioni della
soluzione di cristallizzazione, come ad esempio
piccole variazioni nel pH, possono portare ad
avere impaccamenti diversi e si possono quindi
ottenere forme cristalline differenti. Le
strutture di alcune molecole di proteina (ad
esempio il lisozoma e la mioglobina) sono quindi
state determinate in diverse forme cristalline,
ma risultano sostanzialmente uguali, ad eccezione
di alcune catene laterali che sono coinvolte
nellimpaccamento. Proprio perché le interazioni
tra le molecole proteiche in un cristallo sono
poche, esse non modificano la struttura
complessiva della proteina anche avendo un
diverso impaccamento. Tuttavia, diverse forme
cristalline possono avere un diverso grado di
ordine e quindi dare un quadro di diffrazione di
diversa qualità. In generale, più le molecole
sono strettamente impaccate e quindi meno acqua
contiene il cristallo, migliore è la diffrazione
che si ottiene poichè le molecole nel cristallo
sono più ordinate.