XAPERONES

1
XAPERONES

• Estrada Gelonch, Anaïs
• Gallastegui Calvache, Edurne
• Garí Barbarà, Mercè
• Guerra Rebollo, Marta
• Milà Canals, Jordi

2
Xaperones

• Conjunt de proteïnes molt divers. Presència en
  totes elles dels dominis importants per la
  funció,
• Dos funcions principals
• Xaperones moleculars ajuden al plegament de les
  proteïnes recentment sintetitzades o
  desnaturalitzades i al transport/translocació
  daquestes a través de les membranes
  intracel.lulars.
• Paper important en la degradació de proteïnes.
  Formen part de la via de degradació depenent de
  ubiquitina.
• Necessiten ions per funcionar correctament (Mg2,
  Ca2,...)
• Hidrólisis ATP activació
  xaperona
• Estructura molt diversa.

3
Famílies de xaperones

• Famílies de xaperones que sexplicaran
• Hsp70
• Hsp40 (coxaperona)
• Hsp60
• Hsp100
• Hsp90

4
Manteniment de la funció xaperona
5
Hsp70

• Ajuda a plegament de proteïnes en formació
• Guia translocació a través de membranes
• Desensamblatge de proteïnes oligomèriques
• Control dactivitat de poteïnes reguladores
  plegades

6
Dominis
Domini unió ATP/ADP
Domini unió substrat

• Classe alfa/beta (unitats beta-alpha-beta)
• Plegament Ribonuclease
• H-like motif
• Superfamília actin-like ATP
• domain
• Família actin/Hsp70

• Classe proteïnes multi-domini (alfa i beta)
• Plegament 2 dominis (1) beta-sandwich 8
  cadenes 2 fulles (2) 2 alpha-helix
• Superfamília domini C-ter unió
• al substrat
• Família domini C-ter unió
• al substrat

7
Cicle ATP-substrat

• Alternança de 2 estats
• Unit a ATP (baixa afinitat substrat)
• Unit a ADP (elevada afinitat substrat)
• Associació substrat (Hsp-ATP)
• Hidròlisi estabilitza interacció Hsp70-pèptid ?
  pas limitant
• Importància de coxaperona

8
Domini dunió a substrat

• ß-Sandwich
• 2 fulles ß de 4 cadenes
• 2 a-hèlix
• 4 loops ? butxaca
• dunió a substrat

9
Substrat

• Residus hidrofòbics
• (nucli central 3 Leu)
• Freqüents en la cadena polipeptídica

10
Butxaca hidrofòbica
M404
A429
S427
I438
Q433
V436
A435
F426
I472
11
Comparació entre espècies(E.coli-rata)

• - Clustalw

12

• - Stamp

RMS 2.08
13
Domini dunió a ATP

• 2 subdominis globulars
• Separats per ranura central
• Connectats per 2 hèlix creuades

14
Loop 1
Loop 2
15
Unió Mg
- Residus àcids
16
Hidròlisi de lATP
1r pas
Gly203
Gly202
Thr13
17
2n pas
Lys71
18
3r pas
Thr204
Thr13
Lys71
19
Comparació entre espècies
(Humà-E.coli-vaca)
Humà
E.coli
Vaca
20
STAMP
RMS 1.59
21
Hsp70 - Actina
22
Hsp70 Actina
Alineament estructura
Alineament seqüència
ClustalW (10 homologia)
STAMP
Superposició
Superposició
23
- ClustalW
24
- STAMP
RMS 2.13
25
Hsp70 Glicerol quinasa
26
Hsp70 Actina
Alineament estructura
Alineament seqüència
ClustalW
STAMP (opcions avançades)
Xam (fulles beta)
Superposició
Superposició
Superposició
27
- ClustalW
28
- Xam
RMS 3.40
29
COXAPERONESde Hsp70/DNAK i Hsc70
30
Hsp40 i DNAJ
N-ter Domini Zn Unió substrat
31
STAMP Superposició dels dominis J
STAMP (2)
Superposicio amb vaca
RMS 1.80
RMS 6.60
32
Superposicio final del J-domain
PDB
XAM
A partir de regió HPD
PDBtoSplitChain.pl
Superposició
STAMP
PDBtoRotate.pl
J-domain HPD
Superposicio
Fins ara...
33
Superposicio final del J-domain (2)
Alineament seqüència arreglada
Aa conservats, P-loop
Helix I
Helix II
Helix III
Helix IV
34
Superposicio final del J-domain (3)
E.coli H.Sapiens Virus Vaca
HPD
RMS 1.85
35
Domini J
SCOP Classe proteïnes tot alfa Plegament
alfa-hairpin Superfamília domini J de
xaperones Família domini J de xaperones
36
DNAJ (1bq0.pdb) Interaccions electrostàtiques
dins del domini J
Arg21, Lys22, Lys25, Arg26, Lys30
Glu41, Glu43, Glu48, Glu51
Hèlix II
Hèlix III

-
NMR
37
DNAJ-DNAK
QKRAA i HPD
Tyr6, Leu9, Ala52 i Leu56
Hèlix IV
Hèlix II
Hèlix III
HPD
38
DNAJ-DNAK
Domini dunió a ATP DNAK
Asn170 i Thr173
Arg167
Val11, Ser12, Ala15, Arg18, Glu19, Ile20, Arg21,
Ala23, Tyr24, Lys25, Arg26, Leu27, Met29, Lys30,
Tyr53 i Thr57.
Domini J DNAJ
Asp34
(HPD)
Hèlix II
39
Hsp40 (1hdj.pdb)
His
Pro
Asp
NMR
40
Hsp40
Residus implicats en lestabilització del core i
la interacció amb Hsp70
Nt Hèlix I
Hèlix III
Ct
Ala49
Hèlix II
Hèlix III
P-loop
41
Hsp40-Hsp70
Lys, Arg i His de lhèlix II
-
Glu, Asp

Domini J Hsp40
Domini dunió a ATP Hsp70
42
Domini J de lantigen T de poliomavirus de rata
(1faf.pdb)
Glutamines 31, 32 i 36
Lys35

• Domini J (PyJ) a lextrem N-terminal dels
  Antigens T de poliomavirus de rata
• No hi ha una quarta hèlix.
• Coxaperona de Hsp70

Residus de lhèlix II que reconeixen carboxilats
de la superfície de Hsp70
NMR
43
El motiu HPD de PyJ
Pro43 (C)
Asp44 es posiciona
Interacció amb Arg Hsp70
His42 (Cc)
stacking
44
Domini J de lAntigen T de SV40(1gh6.pdb)
Model proposatAgT-Hsc70 DNAJ-DNAK
AgT
AgT-Hsc70 Hidròlisi ATP Rb i E2F es disocien
Rb
Resolució 3.20
45
Rigidesa a lAg T
Ponts dhidrogen
Força dstacking
Lys45
Asp44
His42
Loop L2
Glu40
Phe41
Pro43
46
Flexibilitat a lAgT
Gly46
Gly47
47
Similaritat DNAJ-AgT(coxaperones)
Majoria dels residus implicats en formació del
core
RMS 2.10
48

• A DNAJ Arg22, Tyr25, Tyr32, Tyr54 i Thr58 estan
  exposats
• Residus equivalents a l'antigen T estan enterrats
  pel loop L3 i l'hèlix alfa4

Loop L3
Hèlix alfa4
49
Similaritat DNAK-Hsc70(xaperones)
RMS 1.48
50
Hsp60 (xaperonina)
51
Xaperona 60 (xaperonina)

• 2 grans grups
• Grup I ? GroEL (bactèries, mitocòndries,
  cloroplasts)
• Grup II ? CCT (citosol deucariotes, Archaea)
• 2 funcions (grupI)
• Impedir agregació de pèptids mig plegats
• Plegament de proteïnes parcialment plegades

52
GroEL vs GroEL-GroES

• 2 anells (cis i trans)
• 7 subunitats
• GroES
• 60Kda/subunitat

1AON
1KP8
53
Subunitats
Apical
Substrat GroES
Intermig
Moviments Senyals
Nucleòtids Anell trans
Equatorial
54
Passos del plegament

• Unió del polipèptid
• Unió de lATP ? Canvis conformacionals
• Unió de la coxaperona GroES ? plegament
• Hidròlisis de lATP
• Alliberació del polipèptid, GroES i ADP

55
Unió del polipèptid

• Residus hidrofòbics domini apical i substrat
  (mal plegat)
• Reconeixement simple i inespecífic

56
Unió del polipèptid
Leu234
Val264
Leu 237
Val263
Leu259
Tyr203
Phe204
Ser201
Loop (6-7)
Tyr199
57
Unió a lATP
Asp398
Ile150

• Entrada i sortida sense hidròlisi
• Residus importants
• Altres (Asp87, Asp495, Thr89, Thr91, Gly415,
  Ala480 )

58
Unió a lATP

• 2 senyals cooperativitat postiva i negativa ?
  canvi conformacional

59
Unió a lATP (ATP binding site)
Asp398
Ser151
Asp87
Ile150
Asp 398 (OH) suneix al Mg2
Thr91
Gly32
Ala481
Pro33
Ile454
Ala480
60
Els aa dunió a ATP es conserven?
61
(No Transcript)
62
Canvis conformacionals
63
Canvis conformacionals
Gly192
Gly192
Gly375
Gly375
Gly410
Pro137
Pro137
Gly410
Translocació dels residus hidrofòbics (contacte
amb el GroES)
64
Canvi conformacional (STAMP)
GroEL (1KP8)
GroEL-GroES (1AON)
65
GroES
9 fulles ß mobile loop
66
GroES

• Iguals residus (unió pèptid) ? el polipèptid es
  deslliga i cau dins el canal (medi òptim)

67
I per últim...

• Hidròlisi de lATP
• Relaxa la unió GroES-GroEL
• Senyals a laltre anell ? nova unió pèptid i ATP
• Alliberament de lADP, pèptid i GroES

68
Grup II CCT
Subunitat GroEL
Subunitat CCT
69
Hsp100
70
HSP100/Clp

• Proteïnes de 100kDa
• Classes (2) i subfamílies (8)
• Estructura danell
• ATP Hexàmer
• Funcions
• Increment de tolerància a altes temperature
• Promou hidròlisis de substrats específics
• Regulació de transcripció.

71
Mecanisme dacció
72
SCOP
Domini N-terminal

• Classe tot alfa
• Plegament multihelix alfa
• Superfamília dos repeticions estructurals de 4
  hèlix alfa
• Família double ClpN motif

73
ATP1-Middle-ATP2 (ClpB)
Open sheet

• Classe alfa-beta
• Plegament P-loop
• Superfamília P-loop
• Família domini AAA-ATPasa

74
Dominis Walker

• Walker A
• Walker B1
• Walker B2

75
ADP-Mg i dominis Walker

• Interacció entre MG, ADP i motius walker
• Walker A
• Walker B2

Butxaca per ADP-Mg

• Walker A terra de la butxaca
• Walker B2 loop, sostre de
  la butxaca

76
ADP-Mg i dominis Walker

• Walker A
• Walker B1
• Walker B2

ATP
77
Hsp90
78
Hsp903 dominis
Unió subtrat
Unió ATP

• N-t Intermig C-t

79
Estructura dels dominis
?
domini C-t
domini intermig
domini N-t
80
Mecanisme dacció
1. Estat relaxat (no ATP)
2. Unió dATP (interacció amb proteïnes)
3. Unió de la cochaperona
81
Domini N-tplegament
82
Classificació segons SCOPdomini unió ATP/ADP

• Classe alfa beta
• Plegament - fulla beta amb 8 cadenes
• - 2 capes alfa / beta
• Superfamília domini ATPasa hsp90
• Família domini N-terminal hsp90

83
Domini N-tATP-binding domainbutxaca
2 hèlix alfa Loop i final hèlix Cadenes beta
(6 aa) ADP
84
Butxaca dunió a lATP
2 hèlix alfa Loop i final hèlix Cadena beta (6
aa) ADP
ATP
85
Interaccions N-t ATP
86
Ponts dhidrogen
87
Forces de Van der Waals
88
Geldanamicina

• Mimetitza lacció de lATP

ADP
Geldanamicina
89
Domini N-tGeldanamicinabutxaca
2 hèlix alfa Loop i final hèlix Cadena beta (6
aa) Geldanamicina
90
ATP
Geldanamicina
91
Interaccions N-t - GDA
92
PDB 1amw Llevat
PDB 1yet Humà
93
Domini intermig
a ß a a - coil a ß a
94
Sandwich a ß a Sembla plegament Rossman, però...
... creuen que és un nou plegament !!!
95
Enrollament 3 hèlix a (curtes)
96
Sandwich a ß a Fulla ß de 5 cadenes Hèlix a de 3
voltes (i loops irregulars) Hèlix a de 6 voltes
97
Unió a lATP
Catalitic loop Hidrophobic patch
98
N-terminal
180º
Intermig
90º
99
ATP
lid segment
lid segment
Arg 380 Gln 384
Phe 349
100
Conclusió xaperones

• 2 dominis diferents - unió a lATP
• - unió al substrat
• Importància de les coxaperones
• Possible diana terapèutica en carcinogènesi

101
Referències

• Flaherty, K. M. et al. Structural basis of the
  70-kilodalton heat shock cognate protein ATP
  hydrolytic activity. II. Structure of the active
  site with ADP or ATP bound to wild type and
  mutant ATPase fragment. J Biol Chem. 29 269(17)
  12899-907, 1994
• OBrien, M. C. et al. Lysine 71 of the chaperone
  protein Hsc70 is essential for ATP hydrolysis. J
  Biol Chem 5271(27) 15874-8, 1996
• Bukau, B. et al. The Hsp70 and Hsp60 chaperone
  machines. Cell. 6 92(3) 351-66, 1998
• Xu, Z. et al. The crystal structure of the
  asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex.
  Nature, 21 388(6644) 741-50, 1997
• Lund, P.A. et al. The chaperonins perspectives
  from the Archaea. Biochem Soc Trans, 31 (Pt 3)
  681-5, 2003
• Csermely, P. et al. The 90-kDa Molecular
  Chaperone Family Structure, Function, and
  Clinical Applications. A Comprehensive Review.
  Pharmacol. Ther. Vol. 79, No 2 129-168, 1998
• Promodrou, C. et al. Identification and
  Structural Characterization of the
  ATP/ADP-Binding Site in the Hsp90 Molecular
  Chaperone. Cell, Vol. 90 65-75, 1997
• Meyer, P. et al. Structural and Functional
  Analysis of the Middle Segment of Hsp90
  Implications for ATP Hydrolysis and Client
  Protein and Cochaperone Interactions. Molecular
  Cell, Vol. 11 647-658, 2003

102

• http//www.ciencia.cl/CienciaAlDia/volumen4/numero
  2/articulos/articulo1.html
• http//www.ucm.es/info/antilia/asignatura/practica
  s/trabajos_ciencia/caperoninas.htm
• Huang K et al. The influence of C-terminal
  extension on the structure of the J-domain in
  E.coli DnaJ. Protein Science (1999), 8203-214
• Berjanskii M et al. NMR Structure of the
  N-terminal J Domain of Murine Polyomavirus T
  Antigens. The Journal of Biological Chemistry
  (2000), Vol.276, 4626094-26108
• Hye-Yeon Kim et al. Structural basis for the
  inactivation of retinoblastoma tumor supressor by
  SV40 large T antigen. The EMBO Journal
  (2001),Vol.20, 1 2295-304.
•  Szyperski et al. NMR structure determination of
  the E.coli DnaJ molecular chaperone Secondary
  structure and backbone fold of the n-terminal
  region (residues 2-108) containing the highly
  conserved J domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
  (1994)Vol. 9111343-11347.
•  Pellecchia M et al. NMR Structure os the
  J-domain and the Gly/Phe-rich Region of the
  escherichia coli DnaJ Chaperone. J. Mol. Biol.
  (1996), 260, 236-250.
• Cheetham M et al. Structure, function and
  evolution of DnaJ conservation and adaptation of
  chaperone function. Cell Stress Chaperones
  (1998) 3(1)28-36.
•  

103
PREGUNTES PEM
104

• Indica les verdaderes respecte les xaperones
• Les xaperones presenten diversitat estructural.
• Participen en el correcte plegament de les
  proteïnes recent sintetitzades o
  desnaturalitzades.
• Les dues anteriors són certes.
• Participen en la proteòlisi de proteïnes per la
  via de degradació independent d'ubiquitina.
• Totes són certes.
• La resposta correcta és la c).

105

• Indica les opcions falses respecte les xaperones
• 1. La xaperona HSP55 té un domini d'unió al
  substrat.
• 2. Les xaperones moleculars només participen en
  el correcte plegament de proteïnes.
• 3. Les co-xaperones modulen l'activitat de les
  xaperones.
• 4. Totes les xaperones i coxaperones tenen un
  domini d'unió a ATP.
• 1 i 3
• 1, 2 i 3
• 2 i 4
• 4
• 1, 2, 3 i 4
• La resposta correcta és la e).

106

• Digues quina/es de les següents afirmacions és
  CERTA
• La xaperona Hsp70 només sindueix en condicions
  destrés.
• En el cicle dunió ATP-substrat, la unió amb la
  coxaperona és el pas limitant.
• Les dues anteriors.
• Quan la xaperona està unida a ATP té baixa
  afinitat pel substrat i la butxaca dunió a
  aquest es troba oberta.
• Totes les anteriors
• La resposta correcta és la d).

107

• Digues quina de les següents afirmacions és
  FALSA
• El domini dunió al substrat està format per un
  ß-sandwich seguit de 2 a-hèlix
• Els loops formats per les cadenes ß, formen la
  butxaca dunió al substrat.
• El domini dunió a ATP està format per 2
  subdominis llargs i globulars, separats per una
  ranura central i connectats per 2 alfa-hèlix que
  es creuen.
• Hsp70 te una seqüència molt similar a la de
  lactina tot i presentar una baixa estructural.
• La funció de lió Mg en el posicionament del
  fosfat gamma de lATP per tal que pugui patir
  latac nucleofílic sembla ser crítica en el
  procés dhidròlisi.
• La resposta correcta és la d).

108

• Pel que fa a les coxaperones, és cert que
• Les interaccions entre les coxaperones i les
  respectives xaperones es donen per forces
  electrostàtiques.
• El domini J de la coxaperona és el més important
  en la interacció coxaperona-xaperona
• Les dues anteriors són certes
• DNAJ és la coxaperona de DNAK.
• Totes les anteriors són certes.
• La resposta correcta és la e).

109

• Pel que fa a la Hsp60, digues quina és la
  correcta
• Els residus encarregats de la unió del polipèptid
  per part de la GroEL són residus de caràcter
  hidrofílic
• La coxaperona de les xaperonines GroEL sanomena
  GroES
• Les dues anteriors
• LATP suneix al domini apical de les subunitats
  de la GroEL
• Totes les anteriors
• La resposta correcta és la b).

110

• Digues quina és la correcta en relació a la
  Hsp60
• Les xaperonines del tipus GroEL estan formades
  per dos anells (cis i trans) que generen un canal
  on es pot plegar el polipèptid
• La unió de lATP a les subunitats de la GroEL
  provoca canvis conformacionals en aquestes
  subunitats
• Les dues anteriors.
• Alguns residus pels quals suneix la coxaperona
  de la GroEL són els mateixos que els que utilitza
  el polipèptid per a unir-se a la GroEL
• Totes les anteriors.
• La resposta correcta és la e).

111

• La Hsp90 (xaperona 90)
• Presenta 3 dominis N-terminal, intermig i
  C-terminal
• Lestructura del domini C-terminal no està
  cristalitzada
• És pròpia dorganismes eucariotes
• No necessita ATP per realitzar la seva funció.
• 1 i 3
• 1, 2, 3
• 2 i 4
• 4
• 1, 2, 3 i 4
• La resposta correcta és la b).

112

• La butxaca dunió a lATP de la Hsp90 (xaperona
  90)
• Es troba al domini N-terminal
• Interacciona amb lATP a través de ponts
  dhidrogen
• També pot interaccionar amb la geldanamicina, un
  fàrmac anticancerígen.
• El domini intermig intervé en la catàlisi de
  lATP
• 1 i 3
• 1, 2, 3
• 2 i 4
• 4
• 1, 2, 3 i 4
• La resposta correcta és la e).