TECNICHE DI GENETICA MOLECOLARE

1
TECNICHE DI GENETICA MOLECOLARE
2
Tecnologie di base Polymerase Chain Reaction
(PCR) Sequenziamento del DNA Endonucleasidi
restrizione Ibridazione di acidi nucleici
3
PCR reazione polimerasica a catena

• Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio
  Nobel 1993)
• Serve per ottenere una grande quantita di una
  specifica sequenza di DNA in vitro
• Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1
  milione di volte

4
ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE 1- DNA stampo
che contenga la regione da amplificare 2- Due
oligonucleotidi complementari a due regioni che
si trovano su filamenti opposti del DNA stampo ai
lati della regione che si vuole amplificare 3-
Polimerasi termostabile (non viene denaturata se
portata a 95C) 4- I 4 desossinucleotidi
trifosfati
5
IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI
CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3
PASSAGGI 1- Denaturazione Il DNA stampo
viene denaturato, i due filamenti si
separano 95C 2- Appaiamento I Primers si
appaiano con il DNA stampo 55-65C 3-
Sintesi E ottimale per il funzionamento della
TAQ polimerasi 72C
6
(No Transcript)
7
PCR amplificazione
numero cicli 1 3 10 15 20 25 30
numero sequenze bersaglio 0 2 256 8192 262.144 8.3
88.608 268.435.456
La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA
sintetizzata tra i due primers
8
PCR rivelazione di uno specifico mRNA ..
RT-PCR

• Estrazione dellRNA
• Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa

9
RETROTRASCRIZIONE
SPECIFIC PRIMING
mRNA
AAAAA
cDNA
3 PRIMER
OLIGO dT PRIMING
RANDOM PRIMING
10
PCR utilizzata per rivelare uno specifico
mRNAPCR in seguito a trascrittasi inversa
(RT-PCR)
cDNA
TTTTTTTT 5
mRNA

• Amplificazione della sequenza di interesse con
  oligonuceotidi di innesco specifici

5
3
TTTTTTTT 5
AAAAAAAA 3
5
3
5

• Analisi dei prodotti dellamplificazione
  (elettroforesi)

11
(No Transcript)
12
ELETTROFORESI Migrazione di ioni o molecole
sottoposte ad un campo elettrico
applicato SEPARAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA IN
BASE ALLE LORO DIMENSIONI
I frammenti più piccoli migrano più velocemente
rispetto a quelli più grandi.
Dopo la corsa elettroforetica i campioni di DNA
vengono visualizzati ad un transilluminatore UV
come bande fluorescenti mediante lutilizzo di
etidio bromuro, una sostanza fluorescente che si
intercala nellacido nucleico.
13
La velocità di migrazione dipende dalle
dimensioni del frammento di acido nucleico Le
molecole più grandi incontrano maggior resistenza
nelle maglie del gel rispetto alle molecole di
dimensioni più piccole Molecole più piccole
migrano più velocemente Molecole più grandi
migrano più lentamente
14
ELETTROFORESI CAPILLARE Migrazione dei campioni
allinterno di un capillare Strumenti
automatizzati per lanalisi di frammenti e
lanalisi di sequenze Utilizzo per
lamplificazione di un primer fluorescente
Vantaggi Velocità di corsa Analisi di ridotte
quantità di campione Alto potere risolutivo
15
VANTAGGI DELLA PCR SENSIBILITA Si possono
amplificare regioni specifiche di DNA avendo a
disposizione pochissimo materiale di
partenza VELOCITA In poche ore è possibile
lamplificazione del frammento desiderato
16
LIMITI DELLA PCR SENSIBILITA La tecnica è
suscettibile di contaminazioni da parte
delloperatore o da parte di precedenti prodotti
di amplificazione NECESSITA DI NOZIONI A
PRIORI E necessario avere informazioni precise
sulla sequenza da amplificare DIMENSIONE DEI
PRODOTTI DI AMPLIFICAZIONE In condizioni standard
i prodotti della PCR non possono superare le 5000
paia di basi
17
(No Transcript)
18
SEQUENZIAMENTO DIRETTO
19
SEQUENZIAMENTO DIRETTO
Il sequenziamento degli acidi nucleici è il
miglior modo per ottenere informazioni precise e
definitive su un gene o una sua parte
20
(No Transcript)
21
ELICA STAMPO
T
A
P
P
Il metodo di Sanger si basa sul meccanismo della
replicazione del DNA
C
G
P
P
T
ELICA NEOSINTETIZZATA
P
A
P
A
P
P
P
A
P
G
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
(No Transcript)
26
A C G T
27
(No Transcript)
28
ELETTROFEROGRAMMA
29
MUTAZIONE ETEROZIGOTE
FORWARD
REVERSE
Wild-type
Mutato
SOSTITUZIONE C-gtT PRESENZA DI UN DOPPIO PICCO
30
Dal punto mutato si sovrappongono due diverse
sequenze
31
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE
32
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE Enzimi che tagliano
il DNA in tutti i punti che contengono una
piccola e specifica sequenza di riconoscimento
lunga solitamente 4-8 nucleotidi Le sequenze di
riconoscimento per la maggior parte delle
nucleasi di restrizione sono normalmente
palindrome (la sequenza di basi è identica su
entrambi i filamenti quando ciascuno di essi
venga letto in direzione 5-gt3)
33
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE -Sono stati isolati
più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più
di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze
palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi). EcoRI E
genere Escherichia co specie coli
G/AATTC R ceppo RY13 CTTAA/G I
prima endonucleasi isolata BamHI B
genere Bacillus am specie amylolique
faciens G/GATCC H ceppo H CCTAG/G I
prima endonucleasi isolata
34
Il taglio del DNA è perfettamente simmetrico e
genera frammenti con estremità piatte.
5 GGCC 3 3 CCGG 5
BLUNT
HaeIII
5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5
BamHI
5-PROTRUDING
Possono formare legami idrogeno tra le due code a
filamento singolo complementari. Le estremità
coesive facilitano la reazione della DNA ligasi.
5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5
EcoRI
5 GCGC 3 3 CGCG 5
HhaI
3-PROTRUDING
35
Valutazione della presenza della mutazione 191CgtT
(Q33X) nel gene TREM2 in una famiglia con una
forma di demenza precoce a trasmissione
autosomica recessiva.
36
Valutazione della presenza della mutazione
1216CgtT nellesone 12 del gene NF2 in una
famiglia con neurofibromatosi di tipo 2
(autosomica dominante).
ALLELE WT
a
b
ALLELE MUT
Alleli WT,WT MUT,MUT
WT,MUT
La mutazione inserisce il sito di taglio per
lenzima PstI.
37
IBRIDAZIONE ACIDI NUCLEICI
38
IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

• Ibridazione appaiamento di 2 molecole di DNA o
  RNA complementari
• Complementarieta una sequenza nucleotidica S e
  la complementare di S se i due filamenti possono
  appaiarsi secondo la regola di Watson e Crick

39
La denaturazione non è un processo
irreversibile. Infatti se dopo la separazione
delle eliche si fa scendere gradualmente la
temperatura, le singole eliche complementari si
possono riappaiare e la doppia elica può
riformarsi. Questo processo si chiama
ibridazione.
40
SONDA
Specifica sequenza di DNA marcato capace di
legarsi ad una sequenza complementare presente
sul cromosoma
41
Il Southern blot permette di rivelare la presenza
di specifiche sequenze di DNA in una miscela
complessa di acidi nucleici.
Per capillarità, la soluzione tenderà ad
attraversare il gel e la membrana risalendo verso
i fogli assorbenti. I sali disciolti nella
soluzione trascinano i segmenti di DNA in
verticale, depositandoli sullo strato del
supporto solido con il quale instaurano legami
elettrostatici.
La membrana viene quindi separata dal gel e
immersa in una soluzione contenente la specifica
sonda marcata che ibriderà soltanto con le
sequenze complementari presenti sul filtro
permettendo la loro identificazione.
Filtro di nitrocellulosa
Gel
Carta assorbente
Nitrocellulosa
Gel
Spugna
SOLUZIONE ALCALINA
Trasferimento
Ibridazione con la sonda specifica
16 ore
DNA digerito con endonucleasi di restrizione e
sottoposto ad elettroforesi su gel dagarosio.
La denaturazione dellacido nucleico serve per
ottenere frammenti a singola elica e permettere
la successiva ibridazione con una sonda
42
SOUTHERN BLOT Permette di evidenziare difetti
molecolari quali delezioni e riarrangiamenti
genici Il bersaglio è il DNA genomico
NORTHERN BLOT Permette di stabilire il
pattern di espressione del gene dinteresse Il
bersaglio è costituito dallRNA
43
Il Northern blot è una tecnica usata per
determinare in quale tessuto o tipo cellulare è
espresso un gene, ed anche la lunghezza e la
quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spesso
correlati ai livelli di proteina presente nel
tessuto.
44
DIAGNOSI MOLECOLARE DI MALATTIE GENETICHE
45
TEST GENETICICAMPIONI BIOLOGICI

• Sangue periferico
• Bulbi piliferi
• Mucosa orale
• Fibroblasti cutanei
• Cellule fetali
• Amniociti
• Villi coriali
• Sangue di cordone ombelicale
• Ecc. ecc.

46
INDAGINI CITOGENETICHE ANALISI CHE CONSENTONO
LO STUDIO DELLASSETTO CROMOSOMICO DELLE CELLULE
E QUINDI IL CARIOTIPO
Ritardo mentale Anomalie congenite multiple
Limite di risoluzione 4 Mb
47
DIAGNOSI MOLECOLARE
48
DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA DIRETTA
49
DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA ANALISI DI
LINKAGE Si adotta qualora il difetto molecolare
non sia noto oppure non sia possibile
identificare la mutazione in tempi ragionevoli
Vengono utilizzati dei marcatori associati alla
malattia e ne viene seguita la segregazione
allinterno della famiglia.
50
MARCATORE GENETICO locus genico che identifica
univocamente una regione cromosomica
STABILE NELLE GENERAZIONI POLIMORFICO deve
possedere almeno 2 alleli allele più raro deve
avere una frequenza di almeno 1 nella
popolazione FACILMENTE IDENTIFICABILE
SEGREGAZIONE MENDELIANO PRESENTE IN QUALSIASI
TESSUTO
RFLP Minisatelliti Microsatelliti SNP
MAPPA GENETICA definisce le relazioni lineari
tra i marcatori molecolari
51
(No Transcript)
52
(No Transcript)
53
(No Transcript)
54
1
126 bp
128 bp
2
55
(CAG)n
56
Gene A Gene malattia
aa
AA
aa
Aa
aa
aa
Aa
Aa
Aa
LA DIAGNOSI CONSENTE DI STABILIRE SE IL PROBANDO
HA EREDITATO O MENO DAI GENITORI I CROMOSOMI CHE
PORTANO LA MUTAZIONE PATOLOGICA
57
DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA

• Distinguere i due cromosomi
• del genitore che possono
• aver trasmesso il gene
• patologico (si usa un
• marcatore strettamente
• associato per il quale essi
• siano eterozigoti)

• Scoprire quale cromosoma sia
• stato trasmesso al probando

La malattia dovrebbe essere adeguatamente mappata
in modo da usare marcatori associati al locus
della malattia
58
DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA .LIMITI
E NECESSARIA LANALISI DI DIVERSI MEMBRI DELLA
FAMIGLIA
59
DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA LIMITI
EVENTUALI EVENTI RICOMBINATIVI TRA I MARCATORI ED
IL GENE RESPONSABILE DELLA PATOLOGIA POSSONO
RENDERE I RISULTATI INATTENDIBILI
UTILIZZO DI MARCATORI TELOMERICI E CENTROMERICI
AL GENE MALATTIA
60
DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA DIRETTA
61
DIAGNOSI MOLECOLARE DIRETTA
LA MUTAZIONE RESPONSABILE DI UNA PATOLOGIA VIENE
RICERCATA E RILEVATA DIRETTAMENTE SU DNA, RNA O
PRODOTTO PROTEICO DEL PROBANDO. QUESTO TIPO DI
DIAGNOSI PUÒ ESSERE ESEGUITA SU UN SINGOLO
SOGGETTO
62
TEST GENETICO SUL PROBANDO
RICERCA DI MUTAZIONE
MUTAZIONE IDENTIFICATA?
SI
NO
TEST GENETICO NEI FAMILIARI A RISCHIO
ANALISI DEL DNA NON INFORMATIVA
PORTATORE
NO TEST GENETICO NEI FAMILIARI A RISCHIO
NON PORTATORE
63
SCELTA DEL METODO DIAGNOSTICO

• ETEROGENEITA GENETICA
• DIMENSIONI DEL GENE
• TIPI DI MUTAZIONE
• NUMERO DI CAMPIONI DA TESTARE
• RICERCA DI MUTAZIONI NOTE O IGNOTE

64
ETEROGENEITA GENETICA
ETEROGENEITA DI LOCUS MUTAZIONI A LOCI DIVERSI
PORTANO ALLA STESSA PATOLOGIA A
seconda della localizzazione cromosomica e della
funzione dei geni coinvolti, una stessa
malattia può avere diversi meccanismi di
trasmissione Retinite pigmentosa 12 forme
autosomiche dominanti 5 forme autosomiche
recessive 3 forme legate allX
ETEROGENEITA ALLELICA PAZIENTI DIVERSI SONO
PORTATORI DI MUTAZIONI DIVERSE ALLO STESSO LOCUS
65
SCELTA DEL METODO DIAGNOSTICO

• ETEROGENEITA GENETICA
• DIMENSIONI DEL GENE
• TIPI DI MUTAZIONE
• NUMERO DI CAMPIONI DA TESTARE
• RICERCA DI MUTAZIONI NOTE O IGNOTE

66
IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE
ANALISI DI RESTRIZIONE AMPLIFICAZIONE
ALLELE-SPECIFICA ALLELE SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE
ASSAY (ASO) OLIGONUCLEOTIDE LIGATION ASSAY
(OLA)
67
IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE
ANALISI DI RESTRIZIONE RFLP (Restriction
Fragment Lenght Polymorphism) Una mutazione con
sostituzione di una base può creare o eliminare
un sito di restrizione
68
Endonucleasi di restrizione
EcoRI non taglierà questa sequenza
69
FAMILIAL MEDITERRANEAN FEVER GENE MEFV
Gene map locus 16p13
70
AMPLIFICAZIONE IN PCR DIGESTIONE
ENZIMATICA CONTROLLO DELLE DIMENSIONI DEI
PRODOTTI SU GEL
GENE NF2 TAC-gtTAG TYR-221gtSTOP
NORMALE GTAC TAGLIO CON RsaI MUTATO GTAG PERDE
IL SITO RsaI
71
IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE
AMPLIFICAZIONE ALLELE-SPECIFICA ALLELE SPECIFIC
OLIGONUCLEOTIDE ASSAY (ASO) OLIGONUCLEOTIDE
LIGATION ASSAY (OLA)
72
Diagnosi di mutazioni amplificazione
allele-specifica
C wt A mut
I primers allele-specifici differiscono per il
nucleotide allestremità 3del filamento la
sintesi dellamplificato nella reazione di PCR
dipende dal corretto appaiamento di questa
estremità
Per ogni campione vengono allestite due reazioni
di PCR utilizzando in ogni reazione il primer
comune in combinazione con quello corrispondente
rispettivamente alla sequenza normale e a quella
mutata
WT ETEROZIGOTE MUTATO
WT MUT WT MUT WT
MUT
73
Diagnosi di mutazioni ibridazione con sonde
allele-specifiche
74
Vengono sintetizzate sonde oligonucleotidiche sia
per lallele normale che per quello mutato. Il
mismatch corrispondente alla mutazione si trova
nella parte centrale delloligonucleotide così da
massimizzare linstabilità degli eteroduplex.
In condizioni di ibridazione adeguatamente
stringenti sonde sintetiche ibridano solo con la
sequenza capace di dare appaiamento perfetto
Il DNA viene fissato su un supporto solido
(membrana di nylon o nitrocellulosa), e viene
ibridato sia con la sonda corrispondente
allallele normale sia con la sonda
corrispondente allallele mutato. Mutazione in
omozigosi la sonda complementare alla sequenza
dell'allele normale non ibrida, Mutazione in
eterozigosi ibridano sia la sonda complementare
alla sequenza dell'allele normale sia quella
complementare all'allele mutato.
75
Reverse dot blot Sul filtro sono fissate le sonde
oligonucleotidiche corrispondenti alle forme
normali e mutate.
DF508 in CFTR gene
Normal allele
CFTR allele
76
METODI PER IDENTIFICARE LA PRESENZA DI MUTAZIONI
IN REGIONI NON DEFINITE DEL GENE
77
SEQUENZIAMENTO DIRETTO
Il sequenziamento degli acidi nucleici è il
miglior modo per ottenere informazioni precise e
definitive su un gene o una sua parte
78
METODI PER IDENTIFICARE LA PRESENZA DI MUTAZIONI
IN REGIONI NON DEFINITE DEL GENE
METODI DIAGNOSTICI
ANALISI DEGLI ETERODUPLEX
79
Analisi degli eteroduplex. Si formano quando un
frammento amplificato di DNA mutato ed uno di DNA
wild-type vengono denaturati termicamente e
lasciati ricombinare. ETERODUPLEX combinazione
di due catene di DNA a singolo filamento non
perfettamente corrispondenti, con presenza di un
"rigonfiamento" dove è localizzato il mismatch.
80
DHPLC (Denaturing High-Performance
Liquid Chromatography) SSCP (Analisi dei
Polimorfismi di Conformazione delle Singole
Eliche)
ANALISI DEGLI ETERODUPLEX
Gli eteroduplex hanno profili di denaturazione
anomali.
81
DHPLCDENATURING HIGH-PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY
È una tecnica per la rilevazione di mutazioni
(SNPs, inserzioni, delezioni e tandem repeat)
presenti in eterozigosi. Sfrutta la differente
velocità di migrazione di eteroduplex e
omoduplex, in un mezzo simile ad un gel quale è
la colonna HPLC.
OMODUPLEX WT
I duplex si formano quando un frammento
amplificato di DNA mutato ed uno non mutato
vengono denaturati termicamente e lasciati
ricombinare La presenza di picchi aggiuntivi
rispetto a quelli attesi dall'eluizione delle
sole molecole omoduplici rivela la presenza di
una mutazione in eterozigosi.
ETERODUPLEX
OMODUPLEX MUT
DENATURAZIONE
RINATURAZIONE
82
CROMATOGRAMMI DEGLI ESONI 39, 41, 6 E 23 DEL
GENE DELLA DISTROFINA IN MASCHI SANI vs MASCHI
AFFETTI DA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
83
SSCP ANALISI DEI POLIMORFISMI DI CONFORMAZIONE
DELLE SINGOLE ELICHE
La mobilità elettroforetica di una particella in
un gel dipende sia dalle sue dimensioni che
dalla sua forma In condizioni non
denaturanti il DNA a singolo filamento si ripiega
in maniera dipendente dalle sue interazioni
molecolari, e quindi, dalla sua sequenza.
WT MUT
Nellanalisi SSCP una sequenza mutata è
evidenziate dalla variazione della sua mobilità
elettroforetica (causata dallalterazione della
sua conformazione secondaria) in un gel di
poliacrilamide non denaturante
84
SSCP
SENSIBILITA 80 NEL RIVELARE SOSTITUZIONI DI
SINGOLE BASI IN FRAMMENTI DI DIMENSIONI INFERIORI
A 200 bp
85
RIARRANGIAMENTI GENOMICI

• SOUTHERN BLOT

probe
EcoRI
EcoRI
AA AB BB
probe
EcoRI
EcoRI
AA AB BB
probe
EcoRI
EcoRI
probe
EcoRI
EcoRI
86
Diagnosi della sindrome da androgeno resistenza
per mezzo dellanalisi del Southern blot
Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su
nitrocellulosa ed ibridizzato alla sonda cDNA di
un recettore androgenetico. Si osservano 3
frammenti genomici nel DNA di entrambi i genitori
ma non in quello del figlio. Conclusione Il
gene per il recettore androgenetico (AR) è
X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto
(lintensità delle bande è simile a quella della
padre). Il figlio ha ereditato dalla madre il
cromosoma X che ha una delezione nel gene AR.
87
Emocromatosi ereditaria
88
Emocromatosi ereditaria
Autosomica recessiva Frequenza dei portatori
1/10 Omozigoti o Eterozigoti composti 1 su
400 Manifestazioni cliniche
51 maschifemmine Età dinsorgenza -
gt 40anni
89
Emocromatosi ereditaria
Patologia da eccessivo deposito di ferro

• CUTE aumentata pigmentazione
• PANCREAS diabete ad insorgenza tardiva
• FEGATO cirrosi, neoplasie
• CUORE scompenso cardiaco
• IPOFISI riduzione libido/impotenza

90
Gene map locus 6p21.3
C282Y è la mutazione più frequente
nell'emocromatosi. Presente in omozigosi nel
80-90 dei casi nelle popolazioni nord europee,
(65 in Italia). ISTIDINA 63 ACIDO ASPARTICO
(H63D)
91
Emocromatosi ereditaria
Diagnosi biochimica
Test genetico
Studio del ferro Ferro sierico Saturazione
della transferrina Ferritina sierica
H63D C282Y
His63Asp
Hfe Protein
Biopsia epatica Accumuli di ferro
?2 microglobulin
s
s
s
Cys282Tyr
s
Cytosol
COOH
92
Omozigote C282Y
WT
Eterozigote Composto H63D C282Y
93
FIBROSI CISTICA
 E una delle più comuni malattie monogeniche,
trasmessa come carattere autosomico recessivo. La
sua incidenza è compresa tra 1/1.600 e 1/3.000
nella maggior parte delle popolazioni occidentali
94
MANIFESTAZIONI CLINICHE

• Respiratorie infezioni/infiammazioni delle vie
  aeree inferiori e dei seni paranasali ? malattia
  ostruttiva e insuff. respiratoria
• Gastrointestinali insufficienza pancreatica con
  malassorbimento (?90) ileo da meconio nel
  10-20 dei neonati diabete mellito (15)
• Nei maschi (gt95) azoospermia ostruttiva da
  anomalo sviluppo delle strutture di derivazione
  wolfiana (Assenza Congenita Bilaterale dei Vasi
  Deferenti CBAVD)

95
FIBROSI CISTICA
Patologia Autosomica Recessiva
Madre Portatrice
Padre Portatore
?
?
Portatore 1/2
Sano 1/4
Malato 1/4
96
GENETICA MOLECOLARE

• Causata da mutazioni del gene CFTR
• (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
  Regulator), localizzato in 7q22
• La proteina CFTR è un canale di trasporto ionico
  disposto a livello della membrana cellulare

97
IL GENE CFTR
Struttura 250 kb - 27 esoni
mRNA
6.5 kb
98
La gravità delle conseguenze delle mutazioni va
progressivamente decrescendo dalla classe I alla
classe V. I quadri più gravi di malattia sono
associati alla presenza di 2 mutazioni severe.
Gli eterozigoti composti per una mutazione severa
una lieve hanno manifestazioni più lievi (es.
CBAVD isolata)
99
ETEROGENEITÀ ALLELICA NELLA FIBROSI
CISTICA Oggi sono conosciute più di 1.000
mutazioni (la maggior parte è stata identificata
in singole famiglie)
100
(No Transcript)
101
Standards and Guidelines for CFTR Mutation
Testing American College of Medical Genetics
Genetics in Medicine 2002 4(5)379-391
INDICAZIONI AL TEST test diagnostico, possibile
diagnosi FC test diagnostico, definire una
diagnosi FC test diagnostico, neonati con ileo da
meconio test diagnostico, maschi con CBAVD Test
per il portatore, partner di soggetti con storia
familiare positiva Test per il portatore, parner
di maschi con CBAVB Test per il portatore,
soggetti con storia familiare positiva Test per
il portatore, donatori di gameti Diagnosi
preimpianto test per diagnosi prenatale, coppie
di portatori sani con un rischio 1/4 test per
diagnosi prenatale, iperecogenicità intestinale
nel II trimestre di gravidanza Screening
neonatale
102
TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE
ANALISI DI I LIVELLO L analisi genetica di I
livello consiste nella ricerca delle mutazioni
più frequenti nella popolazione. Le tecniche
utilizzate devono soddisfare criteri di
sensibilità del sistema,riproducibilità e
rapidità, quest ultima in funzione del numero
sempre maggiore di analisi richieste. Possono
essere utilizzate tecniche home made o kit
commerciali
ANALISI DI II LIVELLO L analisi genetica di II
livello utilizza sistemi di scanning del gene
che permettono il riconoscimento di variazioni
della sequenza nelle regioni codificanti e nelle
giunzioni introne/esone del gene CFTR
103
ANALISI DI I LIVELLO

• Reverse Dot Blot (RDB)
• Oligonucleotide Specific Allele (ASO)
• Oligonucleotide Ligation Assay (OLA)

104
OLA
Screening 31 mutazioni
MUTAZIONI INVESTIGATE MUTAZIONI INVESTIGATE
G85E G542X
6211G??T S549N
R117H S549R
Y122X G551D
7111G??T R553X
1078delT R560T
R347P 18981G??A
R347H 2183AA??G
R334W 2789 5G??A
A455E R1162X
DI507 3659delC
DF508 384910KbC??T
1717-1G??A 38494A??G
Q493X W1282X
V520F 3905insT
N1303K
105
ANALISI DI II LIVELLO
SEQUENZIAMENTO DI TUTTO IL GENE

• Il risultato molecolare può essere di difficile
  interpretazione
• Mutazioni causanti malattia
• Varianti fenotipicamente non patologiche