Presentazione di PowerPoint

1
GENOMICA DEL BACILLO TUBERCOLARE Laura
Rindi Dipartimento di Patologia Sperimentale,
Biotecnologie Mediche Infettivologia ed
Epidemiologia - Università di Pisa
2
GENOMICA

• branca della biologia molecolare che si occupa
  dello studio del genoma degli organismi
• studio della struttura, contenuto, funzione ed
  evoluzione del genoma
• Genomica comparativa ? approccio che consente
  lidentificazione di variazioni genetiche tra
  gli organismi che possono spiegare differenze
  nella fisiologia, biochimica e virulenza

3
(No Transcript)
4
Circular map of the chromosome of M. tuberculosis
H37Rv
5
Nature 393, 537-544, 1998 Deciphering the
biology of Mycobacterium tuberculosis from the
complete genome sequence S. T. Cole, et al.
6
CARATTERISTICHE DEL GENOMA DI M. TUBERCULOSIS
H37Rv

• 4.411.532 bp
• GC 65.6
• ? 4.000 geni codificanti proteine
• 50 geni codificanti RNA stabile
• Oltre il 51 dei geni è derivato dalla
  duplicazione genica
• Il 3.4 del genoma è composto da sequenze di
  inserzione e profagi

52 funzione definita 48 funzione ipotetica o
sconosciuta
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CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DEI GENI DI M.
TUBERCULOSIS H37Rv
CLASSE FUNZIONE NUMERO DI GENI
0 Virulence, detoxification, adaptation 99
1 Lipid metabolism 233
2 Information pathways 229
3 Cell wall and cell processes 708
4 Stable RNAs 50
5 Insertion sequences and phages 149
6 PE and PPE proteins 170
7 Intermediary metabolism and respiration 894
8 Proteins of unknown function 272
9 Regulatory proteins 189
10 Conserved hypothetical proteins 1051
8
METABOLISMO LIPIDICO

• 8 del genoma è dedicato al metabolismo lipidico
• (oltre 200 enzimi rispetto ai 50 di E.coli)

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PROTEINE PE E PPE

• 7 dei geni codifica per due nuove famiglie di
  proteine ricche in glicina

Ruolo immunologico
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SEQUENZE DI DNA RIPETUTE

• Duplicazioni di geni/famiglie di geni
• Sequenze di inserzione
• Sequenze non codificanti disperse

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Sequenze di DNA ripetute SEQUENZE DI INSERZIONE

• Le sequenze di inserzione (IS) sono piccoli
  segmenti di DNA (lt2.5kb) in grado di inserirsi in
  siti multipli del genoma.

• Il genoma di M. tuberculosis H37Rv contiene 56
  copie di elementi IS appartenenti ad almeno 9
  famiglie.

FAMIGLIA IS MEMBRI IN M. TUBERCULOSIS
IS3 IS6110 (16), IS1540, IS1604
IS5 IS1560, IS1560, IS-like (2)
IS21 IS1532, IS1533, IS1534
IS30 IS1603
IS110 IS1547 (2), IS1558, IS1558, IS1607, IS1608 (2)
IS256 IS1081 (6), IS1552, IS1553, IS1554
IS1535 IS1535, IS1536, IS1537, IS1538, IS1539, IS1602, IS1605
ISL3 IS1555, IS1557 (2), IS1557, IS1561, IS1606
ignota IS1556

• Ad eccezione di IS6110, che traspone
  frequentemente, gli elementi IS sono stabili in
  H37Rv e in altri isolati.

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Sequenze di DNA ripetute SEQUENZE NON
CODIFICANTI DISPERSE

• Locus DR direct repeat.
• Sequenze ripetute di 36 bp separate da sequenze
  non ripetute (spacers) di 36-41 bp

• MIRU mycobacterial interspersed repetitive
  unit.
• 41 loci
• dimensioni 40-100 bp

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http//genolist.pasteur.fr/TubercuList
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ORGANISM SIZE GC CONTENT PUBLICATION
Mycobacterium tuberculosis H37Rv (lab strain) 4411 Kb4060 orfs 65.6 Nature 393,537-5441998-06-11
Mycobacterium leprae TN 3268 Kb2749 orfs 57.8 Nature 409, 1007-10112001-02-22
Mycobacterium tuberculosis CDC1551 (Oshkosh) 4403 Kb4346 orfs 65.6 J Bacteriol 184, 5479-902001-10-02
Mycobacterium bovis AF2122/97(spoligotype 9) 4345 Kb4012 orfs 65.6 PNAS 100, 7877-78822003-06-24
Mycobacterium avium paratuberculosis K-10 4829 Kb4415 orfs 69.3 PNAS 102, 12344-92004-01-30
Mycobacterium sp MCS 5705 Kb5752 orfs 68 Unpublished2006-06-09
Mycobacterium smegmatis MC2 155 6988 Kb6978 orfs 67.4 Unpublished2006-11-20
Mycobacterium avium 104 5475 Kb5339 orfs 69 Unpublished2006-11-20
Mycobacterium ulcerans Agy99 5631 Kb4291 orfs 65.5 Genome Res 17, 192-2002006-12-01
Mycobacterium sp KMS 5737 Kb6133 orfs 68.4 Unpublished2006-12-20
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 6491 Kb6092 orfs 67.8 Unpublished2006-12-27
Mycobacterium bovis BCG Pasteur 1173P2 4374 Kb4033 orfs 65.6 Unpublished2007-01-08
Mycobacterium sp JLS 6048 Kb5899 orfs 68 Unpublished2007-02-27
Mycobacterium flavenscens (gilvum) PYR-GCK 5619 Kb5723 orfs 67 Unpublished2007-04-12
Mycobacterium tuberculosis H37Ra 4419 Kb4132 orfs 65.6 PLoS ONE 3, e23752007-06-01
Mycobacterium tuberculosis F11 (ExPEC) 4424 Kb4050 orfs 65.6 Unpublished2007-06-07
Mycobacterium abscessus CIP 104536 5067 Kb5041 orfs 64 Unpublished2008-03-01
Mycobacterium marinum M, ATCC BAA-535 6636 Kb5550 orfs 65 Genome Res. Epub2008-04-15
34 ceppi micobatterici completamente
sequenziati 47 ceppi del complesso tubercolare
in corso di sequenziamento
http//www.genomesonline.org/gold.cgi
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M. tuberculosis complex
M. microti
M. tuberculosis
M. africanum
M. canettii
M. bovis
M. bovis BCG
BCG-Pasteur
AF2122/97
H37Rv CDC1551 H37Ra
in corso
in corso
in corso
4.32 Mb
4.31Mb
4.41 Mb
Tutti i micobatteri appartenenti al complesso
tubercolare condividono il 99.9 di identità a
livello nucleotidico, ma differiscono ampiamente
in termini di spettro dospite e di patogenicità
PLASTICITA DEL GENOMA
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Caratteristiche M. tuberculosis H37Rv M. tuberculosis CDC1551 M. bovis AF2122/97
Dimensioni del genoma, bp 4.411.532 4.403.836 4.345.492
GC, 65.6 65.6 65.6
Geni codificanti per proteine 3.995 4.249 3.951
Rispetto a Mtb H37Rv
polimorfismi singoli - 1135 2348
delezioni - 72 117
inserzioni - 63 108

• Il genoma di M. bovis AF2122/97 (identico per
  oltre il 99.5 a quello di M tuberculosis H37Rv)
  rispetto a quelli dei due ceppi tubercolari è più
  piccolo di 70 kb e contiene circa 60 geni in
  meno.
• Il 55 delle inserzioni e delezioni tra i due
  ceppi tubercolari riguardano geni, soprattutto
  quelli codificanti per le proteine PE e PPE.
• La variabilità tra M. bovis e Mtb riguarda
  prevalentemente componenti della parete cellulare
  e proteine di secrezione.

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Regioni genomiche che differiscono tra M.
tuberculosis H37Rv e M. bovis BCG Pasteur
(Esat-6, CFP-10)
(phiRv2)
(fosfolipasi C)
(phiRv1)
(invasina)
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Brosch et al. 2002 PNAS 993684-9.
Scheme of the proposed evolutionary pathway of
the tubercle bacilli illustrating successive loss
of DNA in certain lineages (gray boxes). The
scheme is based on the presence or absence of
conserved deleted regions and on sequence
polymorphisms in five selected genes. Note that
the distances between certain branches may not
correspond to actual phylogenetic differences
calculated by other methods. Blue arrows indicate
that strains are characterized by katG463. CTG
(Leu), gyrA95 ACC (Thr), typical for group
1 organisms. Green arrows indicate that strains
belong to group 2 characterized by katG463 CGG
(Arg), gyrA95 ACC (Thr). The red arrow indicates
that strains belong to group 3, characterized by
katG463 CGG (Arg), gyrA95 AGC (Ser), as defined
by Sreevatsan et al.
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Evoluzione del complesso tubercolare
M. bovis
X
M. tuberculosis
20
Evoluzione del complesso tubercolare
M. bovis
M. tuberculosis
bacillo progenitore
21
Identificazione rapida del bacillo tubercolare
22
Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
ancestral
TbD 1
RD 9
M. tub.
katG 463 CTG?CGG
modern
RD9 -
gyrA 95AGC?ACC
RD 7
RD 8
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AAC?AAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal-isolates
oxyR n285 G?A
RD 12
oryx-isolates
RD 13
goat-isolates
pncAc57CAC?GAC
RD 4
M. bovis
classical
RD 1
BCG Tokyo
RD 2
RD 14
BCG Pasteur
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Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
ancestral
TbD 1
RD 9
M. tub.
katG 463 CTG?CGG
modern
RD9 -
gyrA 95AGC?ACC
RD 7
mmpL6 551 AAG
RD 8
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AAC?AAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal-isolates
oxyR n285 G?A
RD 12
oryx-isolates
RD 13
pncA 57CAC?GAC
goat-isolates
RD 4
M. bovis
classical
RD 1
BCG Tokyo
RD 2
RD 14
BCG Pasteur
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Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
ancestral
TbD 1
RD 9
M. tub.
katG 463 CTG?CGG
modern
RD9 -
gyrA 95AGC?ACC
RD 7
RD 8
RD4 -
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AAC?AAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal
oxyR n285 G?A
RD 12
oryx
RD 13
goat
pncA 57CAC?GAC
RD 4
M. bovis
classical
RD 1
BCG Tokyo
RD 2
RD 14
BCG Pasteur
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Identificazione rapida del bacillo tubercolare
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J. Clin. Microbiol. 41, 1637-1650,
2003 PCR-Based Method To Differentiate the
Subspecies of the Mycobacterium tuberculosis
Complex on the Basis of Genomic Deletions R. C.
Huard, et al.
The composite MtbC PCR typing panel. Illustrated
are the typical MtbC PCR panel typing results for
a single representative of each MtbC subspecies
as well as MOTT (M. avium subsp. avium is shown).
Lanes 1, 16S rRNA 2, Rv0577 3, IS1561' 4,
Rv1510 (RD4) 5, Rv1970 (RD7) 6, Rv3877/8
(RD1) 7, Rv3120 (RD12).
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EVOLUZIONE DI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
28
ERA POST-GENOMICA

• Identificazione di fattori di virulenza
  (confronto genoma Mtb/BCG) e di antigeni
  (proteine PE/PPE) ?comprensione dei meccanismi di
  patogenicità e sviluppo di nuovi vaccini
• Allestimento di test diagnostici rapidi
  (identificazione delle specie del complesso
  tubercolare diagnosi immunologica di infezione
  latente)
• Identificazione di molecole essenziali,
  potenziali bersagli per nuovi farmaci
• Studi evoluzionistici e di epidemiologia
  molecolare

Sviluppo di migliori strategie di controllo
dellinfezione tubercolare