Title: II - Visualiser les mol
1II - Visualiser les molécules dans les cellules
vivantes
2Généralités
- Techniques de microscopie optiques (les moins
traumatisantes) - Marquage fluorescent des molécules à suivre
3Concentrations ioniques
- Microélectrodes (H, Na, K, Cl-, Ca) mais pas
rapide - Indicateurs sensibles aux ions
- luminescents (aequorine de la méduse)
- fluorescents
4Fig 9-38
- Aequorine protéine luminescente en fonction de
Ca libre entre 0,5 et 10 ?M - injection d'aequorine puis
- fécondation
- photo toutes les 4 secondes
- Libération de Ca dans le cytoplasme
- Mais très faible intensité
5Fig 9-39
- Cellule de Purkinje
- Indicateur fluorescent sensible à Ca (fura-2)
- Ca intra cellulaire en fluorescence
- rouge forte Ca (dendrites)
- bleu faible Ca
6Autres indicateurs fluorescents
7Injection intra-cytoplasmique de molécules
marqueur
- Anticorps
- Protéine cellulaire purifiée marquée
- Exemple tubuline
8Fig 18-21 tubuline
9Fig 16-12 tubuline
10Injection intra-cytoplasmique de molécules pour
bloquer une fonction
- Anticorps anti myosine-II dans un Å“uf d'oursin
bloque la division sans bloquer la mitose
11Quatre méthodes d'introduction de molécules dans
la cellule
- Microinjection
- Électroporation
- Vésiculation
- Projection à haute vitesse
12Fig 9-40 (AB)
13Fig 9-40 (CD)
14Molécules captives
- Synthèse d'une forme inactive de la molécule
- Introduction dans la cellule
- Activation à un temps et moment donné par un
faisceau lumineux - eg molécules captives pour Ca, AMPc, GTP, IP3
15Fig 9-41 Caged molecules
- La molécule X devient active après le flash d'UV
16Application
- Molécules fluorescentes piégées
- Grosse modification de la molécule qui doit
rester active ? grosse difficulté ? - Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules
- eg tubuline
17Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine
Avant UV
Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique
Après 1,5 mn
Après 2,5 mn
- Tubuline rhodamine (rouge)
- Dapi ADN (bleu)
- Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres
et invisible avant le rayon d'UV)
18(No Transcript)
19(No Transcript)
20(No Transcript)
21(No Transcript)
22Desai,A1998
23(No Transcript)
24Green Fluorescence Protein
25Fig 9-43 GFP
26GFP 3D
27GFP Topol
28GFP mice
29Fig 9-44 GFP tagging
30GFP
31Fig 9-45 Dynamics of GFP tagging
32III - Culture cellulaire
- Isolement
- Séparation (FACS)
- Culture primaire et secondaire
- Milieu de culture
- Lignée cellulaire
- Transformation
- Congélation
- Clone
- Hybride
33Facs
34Hybride cellulaire
35Production AC monoclonaux
36Culture SEM
37ME Immuno-gold
Immuno gold en ME
38Pistage de molécules dans la cellule
- Pulse-chase
- Patch-Clamp
- Molécules  piégéesÂ
- Les anticorps
- immunofluorescence directe
- immunofluorescence indirecte
39Fig 9-46
40Fig 9-47
Autoradiographie en microscopie électronique
5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de
pancréas
Après 10 mn de chasse
Après 45 mn de chasse
41Fig 9-48
42IV - Fractionnement des cellules et analyse des
molécules