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II - Visualiser les mol

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Aequorine : prot ine luminescente en fonction de [Ca ] libre entre 0,5 et 10 ... eg : mol cules captives pour Ca , AMPc, GTP, IP3. 15. Fig 9-41 Caged molecules. La mol cule ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: II - Visualiser les mol


1
II - Visualiser les molécules dans les cellules
vivantes
2
Généralités
  • Techniques de microscopie optiques (les moins
    traumatisantes)
  • Marquage fluorescent des molécules à suivre

3
Concentrations ioniques
  • Microélectrodes (H, Na, K, Cl-, Ca) mais pas
    rapide
  • Indicateurs sensibles aux ions
  • luminescents (aequorine de la méduse)
  • fluorescents

4
Fig 9-38
  • Aequorine protéine luminescente en fonction de
    Ca libre entre 0,5 et 10 ?M
  • injection d'aequorine puis
  • fécondation
  • photo toutes les 4 secondes
  • Libération de Ca dans le cytoplasme
  • Mais très faible intensité

5
Fig 9-39
  • Cellule de Purkinje
  • Indicateur fluorescent sensible à Ca (fura-2)
  • Ca intra cellulaire en fluorescence
  • rouge forte Ca (dendrites)
  • bleu faible Ca

6
Autres indicateurs fluorescents
  • Autres ions

7
Injection intra-cytoplasmique de molécules
marqueur
  • Anticorps
  • Protéine cellulaire purifiée marquée
  • Exemple tubuline

8
Fig 18-21 tubuline
9
Fig 16-12 tubuline
10
Injection intra-cytoplasmique de molécules pour
bloquer une fonction
  • Anticorps anti myosine-II dans un Å“uf d'oursin
    bloque la division sans bloquer la mitose

11
Quatre méthodes d'introduction de molécules dans
la cellule
  • Microinjection
  • Électroporation
  • Vésiculation
  • Projection à haute vitesse

12
Fig 9-40 (AB)
13
Fig 9-40 (CD)
14
Molécules captives
  • Synthèse d'une forme inactive de la molécule
  • Introduction dans la cellule
  • Activation à un temps et moment donné par un
    faisceau lumineux
  • eg molécules captives pour Ca, AMPc, GTP, IP3

15
Fig 9-41 Caged molecules
  • La molécule X devient active après le flash d'UV

16
Application
  • Molécules fluorescentes piégées
  • Grosse modification de la molécule qui doit
    rester active ? grosse difficulté ?
  • Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules
  • eg tubuline

17
Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine
Avant UV
Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique
Après 1,5 mn
Après 2,5 mn
  • Tubuline rhodamine (rouge)
  • Dapi ADN (bleu)
  • Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres
    et invisible avant le rayon d'UV)

18
(No Transcript)
19
(No Transcript)
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
Desai,A1998
23
(No Transcript)
24
Green Fluorescence Protein
25
Fig 9-43 GFP
26
GFP 3D
27
GFP Topol
  • GFP

28
GFP mice
29
Fig 9-44 GFP tagging
30
GFP
31
Fig 9-45 Dynamics of GFP tagging
32
III - Culture cellulaire
  • Isolement
  • Séparation (FACS)
  • Culture primaire et secondaire
  • Milieu de culture
  • Lignée cellulaire
  • Transformation
  • Congélation
  • Clone
  • Hybride

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Facs
34
Hybride cellulaire
35
Production AC monoclonaux
36
Culture SEM
37
ME Immuno-gold
Immuno gold en ME
38
Pistage de molécules dans la cellule
  • Pulse-chase
  • Patch-Clamp
  • Molécules  piégées 
  • Les anticorps
  • immunofluorescence directe
  • immunofluorescence indirecte

39
Fig 9-46
40
Fig 9-47
Autoradiographie en microscopie électronique
5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de
pancréas
Après 10 mn de chasse
Après 45 mn de chasse
41
Fig 9-48
42
IV - Fractionnement des cellules et analyse des
molécules
  • Techniques biochimiques
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