Technologie DNA

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Technologie DNASTRIP HAIN LIFESCIENCE
HAMMAMET, 20 mai 2005
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Avènement de la biologie moléculaire en diagnostic
Contexte

• Epidémie de SIDA au début des années 80
• Identification du VHC en 1989
• Développement de la PCR dès 1988

Besoins

• Nouveaux besoins diagnostic dus à lémergence
• de nouveaux pathogènes ou de nouveaux traitement
• Besoins de résultats précis et rapides

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PLAN

1. Principes généraux de biologie moléculaire
2. Principe de la méthode DNA strip
3. Application au diagnostic microbiologique
4. Futur développement

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Méthodes de biologie moléculaire
Etude/Analyse des acides nucléiques (ADN/ARN)
Science / Outils

• Amplification
• Polymérase Chain Reaction (PCR) traditionnelle
• ou en temps réel
• Nucleic acid sequence based amplification (NASBA)
• Hybridation in situ
• Hybridation en solution
• Séquençage (Identification par comparaison des
  données obtenues avec bases de données)

Recherche ciblée
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Détection des produits issus de la PCR
Amplicons

• Taille 100-200 pb
• Séquence

Détection non spécifique
Détection spécifique

• Révélation à laide de sondes
• spécifiques
• ELISA (micropuits)
• Dot-blot
• Reverse hybridation

Gel agarose 2
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Schéma protocolaire
Produit pathologique
Culture
Détection directe
Charge virale VIH, CMV Chlamydiae SARM Mycobactér
ies
Identification
Mycobactéries Enterocoques EHEC SARM Mycoplasmes R
echerche des résistances GENOTYPAGE
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Objectifs des tests Genotype

• Faciliter le diagnostic biologique
• Permettre un résultat rapide et fiable
• Réduire les coûts (direct, indirect)
• Démocratiser la biologie moléculaire en
  laboratoire de ville (pas gagné..)

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Principe général des tests Genotype

1. Préparation de lADN
2. Amplification (PCR)
3. Reverse Hybridation
4. Interprétation

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Extraction de lADN
Échantillon
ADN libre
EXTRACTION

• Chauffage 95C
• Sonication 15 min
• Centrifugation

30 minutes
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Amplification PCR de type multiplex
Utilisation de sondes biotinylées

1. Dénaturation 95C
2. Hybridation 55C
3. Élongation 70C

120 minutes
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Reverse hybridation sur bandelettes

1. Dénaturation
2. Hybridation
3. Lavage
4. Conjugué
5. Lavage
6. Révélation colorée

45C
T ambiante
90 minutes
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Matériel reverse hybridation
Incubation à laide dun bain marie
Incubation à laide du TwinCubator
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Interprétation
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Matériel nécessaire

• Pipettes
• Minicentrifugeuse

• Thermocycleur

• Twincubator

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(No Transcript)
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Tests DNASTRIP par HAIN LIFESCIENCE

• Séries GenoType Microbiologie
• Détection des bactéries pathogènes
• Identification du complexe Mycobacterium
  Tuberculosis
• Identification des mycobactéries atypiques
• Recherche des résistances à la rifampicine et à
  lisoniazide
• Recherche et identification directe sur
  prélèvement de 5 mycobactéries
• Identification des EHEC
• Identification des entérocoques et des gènes de
  résistance à la vancomycine
• Identification des staphylocoques, du gène mecA
  et du gène de la leucocidine
• Recherdirecte directe des SARM
• Recherche directe des bactéries
  parodontopathogènes
• Séries GenoType Génétique Humaine
• Détection des affections héréditaires (mutations
  ponctuelles SNP)
• Facteur II / Facteur V
• Hémochromatose
• MTHFR

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STANDARDISATION

• Protocole dextraction
• 2. Profil damplification
• 3. Révélation
• (Temps, température et réactifs)

Commun à tous les tests

• Et Présence de contrôle à tous les niveaux
• Amplification
• Révélation

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Série GenoType Staphylococci

• GenoType MRSA
• GenoType Staphylococci
• GenoType MRSA Direct

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GenoType MRSA/Staphylococci

• Prélever 1 à 3 colonies de la boite de pétri
  dans 300 µL deau
• Chauffer 15 minutes à 100C
• Amplification et révélation

Genotype MRSA
Contrôle conjugué
Contrôle universel
mecA
S. aureus
S. epidermidis
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Genotype MRSA Direct
SCCmec
MRSA
MRSE
MSSA, CNS
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Evaluation GenoType MRSA Direct (Laboratoire Dr.
Limbach)
Nbre découvillons testés n 508 provenant de
242 patients MRSA Culture positive n 37 MSSA
Culture positive n 65
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Séries GenoType Mycobacteries

• GenoType Mycobacterium Direct
• GenoType Mycobacterium CM
• GenoType Mycobacterium AS
• GenoType MTBC
• GenoType MTBDR

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Détection des mycobacteries
Echantillon (Expectoration,
Lavage, Aspiration, etc.)
Détection Directe
Microscopie
Culture liquide
Culture solide (2 milieux différents)
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Quelle espèce mycobacterienne?

• morphologie
• nitrate-réductase
• niacine
• catalase

 
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GenoType Mycobacterium, MTBC

• La différentiation du complexe TB par des
  méthodes conventionnelles est longue (app. 2 3
  semaines), par rapport à la biologie moléculaire
  (4 heures)
• Les espèces non tuberculeuses du complexe sont
  difficiles à identifier biochimiquement.
• La distinction entre BCG et M. bovis est très
  importante.
• La différentiation entre M. bovis et M. bovis
  ssp. caprae est dune aide précieuse, M. bovis
  ssp. caprae (comme M. tuberculosis) étant
  sensible au PZA.

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GenoType MTBC
PCR Multiplex pour la differentiation du complexe
M. tuberculosis (MTBC)
M. tuberculosis M. africanum I M. bovis M. bovis
caprae M. bovis BCG M. microti
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Contrôle conjugué
Contrôle universel
Sonde spécifique du complexe Tuberculosis
Sondes spécifiques des sous-espèces
M. tuberculosis
M. africanum
M. caprae
M. microti
M. bovis
BCG
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GenoType Mycobacterium, MTBC

• Méthode de référence (Technologie NAT)
• Plus haute spécificité grâce à la technologie
  DNA?Strip
• Utilisable à partir de milieu liquide ou solide
• Extraction simplifiée de lADN
• Facile à manipuler
• Automatisation optionnelle
• Facilement intégrable au diagnostic de routine
• Ne nécessite aucun équipement coûteux

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GenoType Mycobacterium CM
Contrôle COnjugué (CC) Une ligne doit se
développer dans cette zone pour documenter la
fixation du conjugué et la révélation colorée.
Contrôle Universel (UC) Cette ligne permet de
détecter toutes les mycobactéries, ainsi que les
bactéries gram positives riches en GC.
Contrôle du Genre (GC) Cette ligne permet de
documenter lappartenance au genre Mycobacterium.
Lintensité de cette bande peut varier selon
lespèce mycobactérienne.
Bandes 417 Sondes spécifiques, se reporter à la
table dinterprétation
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GenoType vs. GenoType Mycobacterium
Mycobacterium CM
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GenoType Mycobacterium CM
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GenoType Mycobacterium AS
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Bandelettes développées
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GenoType MTBDR
Test génétique didentification des résistances à
la Rifampicine et/ou à lIsoniazide à partir de
la culture

• Identification de la résistance à la rifampicine
  par détection des principales mutations du gène
  rpoB
• (codant pour la sous-unité a de la lARN
  polymérase)
• Identification de la résistance à lisoniazide
  par détection des principales mutations du gène
  katG gene (codant pour
• la catalase peroxydase).

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Reaction zones of the GenoType MTBDR
Contrôle Conjugué (CC) Une ligne doit se
développer dans cette zone pour documenter la
fixation du conjugué et la révélation
colorée. Contrôle universel (UC) Cette ligne
permet la détection de toutes les mycobactéries
connues ainsi que des bactéries gram-positives
riche en GC. Seules les lignes qui présenteront
une intensité supérieure à celle du Contrôle
Universel doivent être prises en
compte. Complexe M. tuberculosis (TUB) Cette
ligne comporte une sonde qui shybride avec les
amplicons générés à partir de tous les membres
du complexe Mycobacterium tuberculosis. Si la
ligne TUB zone reste négative, la bactérie testée
nappartient pas au complexe M. tuberculosis et
ne peut donc pas être évalué avec le
test. Sondes rpoB et katG Chaque ligne permet de
détecter les régions des gènes concernés (sondes
Uni) ou permet de documenter soit par leur
absence (sonde type sauvage) ou leur présence
(sondes MUT) une résistance à la rifampicine
et/ou à lisoniazide. Tout profil différent du
type sauvage révèle une résistance de la souche
testée!
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Régions du gène rpoB responsables de la
résistance à la Rifampicine
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Mutations du géne katG à lorigine de la
résistance à lisoniazide
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Interprétation
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GenoType Mycobacteria Direct

• Objectif Détection directe et simultanée du
  complexe M. tuberculosis et de 4 espèces
  mycobactériennes non-tuberculeuses M. avium, M.
  intracellulare M. malmoense et M. kansasii
• Cible ARN mycobactérien
• Principe Amplification de type NASBA suivi
  dune hybridation sur bandelette
• Principal Avantage Contrôle de la présence
  dinhibiteurs grâce à un contrôle interne de
  capture de lARN et des étapes damplification
• Contrôle ARN positif
• TwinCubator avec bloc amplification pour
  lextraction et lamplification de lARN
• Séparateur magnétique Purification de lARN au
  cours de la phase dextraction
• Durée totale entre 4 et 5 heures

Nucleic Acid Sequenced Based Amplification
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Extraction de lARN Capture spécifique sur billes
magnétiques
1. Lyse cellulaire
2. Couplage des billes magnétiques avec les
sondes de capture
3. Lavage
Echantillon décontaminé
Cellules lysées
Lavage x2
Récepteur
Sonde de capture
ARN recherché
ARN recherché
Mélange ICR-CP
Billes magnétiques
Contrôle interne damplification
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Résultats
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(No Transcript)
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Poster Ricai..\..\All Users\Documents\BIOCENTRIC\P
roduits\genotype enteroccocus\poster RICAI
2004.PDF
44
Hier
45
Aujourdhui
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Que sera demain?
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Bandelette Gram-Positive
5 Gènes de Resistance
8 Streptococci
5 Staphylococci
S. pneumoniae
S. aureus
vanA
S. epidermidis
vanB
S. pyogenes
S. haemolyticus
vanC2/3
S. agalactiae
S. hominis
vanC1
S. oralis
S. warneri
mecA
S. milleri
S. simulans
S. mutans
S. dysgalactiae
S. bovis
4 Enterococci
E. faecalis
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavus
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Strip Gram-Negative
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Klebsiella pneumoniae
Extraction quasi-instantannée
Klebsiella oxytoca
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Serratia marcescens
Salmonella enteritidis/typhimurium
Haemophilus influenzae
Pseudomonas aeruginosa
Stenotrophomomas maltophilia
Acinetobacter baumannii
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?

• A quoi ressemblera le déroulement dun test
  bactériologie dans les 10 prochaines années?
• Les techniques daujourdhui seront-elles
  compétitives par rapport aux techniques futures
  en termes de temps et dexposition des
  techniciens aux risques biologiques?
• Quel sera le rôle de la biologie moléculaire
  dans le diagnostic bactériologique ?
• Est-il possible de remplacer les méthodes
  subjectives actuelles par des méthodes plus
  objectives?