Prezentace aplikace PowerPoint

1
MOLEKULÁRNÍ FYLOGENETIKA A TAXONOMIE Nápln kurzu

• Co je to molekulární fylogenetika a molekulární
  taxonomie
• Zvláštnosti molekulárních znaku
• Metody získávání experimentálních dat
• Metody zpracovávání dat
• Biologická interpretace

2
ROZPIS PREDNÁŠEK

• 9. 10. - Zahájení kurzu, taxonomie a molekulárne
  biologické znaky, metody sekvenace DNA
• 16. 10. - Alignment sekvencí (Marián Novotný)
• 23. 10. - Databáze sekvencí a vyhledávání v nich
  (Marián Novotný)
• 30. 10. - Získávání nesekvencních molekulárních
  dat - multilokusové metody (RAPD, RFPL aj.),
  mikrosatelity, minisatelity, izoenzymová a
  alozymová analýza, imunologické metody
• 6. 11. -  SNP, evoluce sekvencí, odhad evolucní
  vzálenosti
• 13. 11. - Fylogenetické stromy I. - Proteinové
  distance, konstrukce fylogenetických stromu z
  matice distancí, anatomie stromu
• 20. 11. - Fylogenetické stromy II. Rate
  heterogeneity, prohledávání prostoru stromu,
  maximální parsimonie
• 27. 11. - Fylogenetické stromy III. - Metoda
  maximum likelihood, Bayéská metoda
• Praktikum 30. 11. Získávání sekvencí z
  verejných databází
• 4. 12. - Fylogenetické stromy IV. - Multigenové
  analýzy, urcení verohodnosti vetvení stromu,
  nalezení korene, testy topologie, datování pomocí
  molekulárních hodin
• Praktikum 7. 12. Tvorba alignmentu, tvorba
  stromu ze sekvencí DNA
• 11. 12. - Identifikace jedincu, urcování
  rodicovství, DNA barcoding
• Speciace a hybridizace, kryptické druhy, príklady
  (Radka Reifová)
• Praktikum 14. 12. Tvorba stromu ze sekvencí
  proteinu
• 18. 12. -  Vnitrodruhová fylogeneze, struktura
  populace a genový tok, fylogeografie, príklady
• Praktikum 21. 12. Bayéské metody, molekulární
  hodiny
• 8. 1. - Speciace a hybridizace, kryptické druhy,
  príklady (Radka Reifová)
• 8. 1. - Prezentace studentu
• Praktikum 11. 1. multigenové analýzy, testy,
  distancní data, analýza migrace

3
ZKOUŠKA
Soucásti zkoušky Písemná cást (5 príkladu)
maximální zisk 10 bodu Ústní cást maximální
zisk 10 bodu Nepovinný esej (2-3 strany) a jeho
prezentace (10 min.) 4 body Hodnocení 11-13
bodu dobre 14-17 bodu velmi dobre 18 a více -
výborne
4
MATERIÁLY KE STUDIU

• WEB (Hampl) http//web.natur.cuni.cz/vlada/molta
  x/
• Moodle klíc k zápisu moltax
• WEB (Flegr) http//web.natur.cuni.cz/flegr/molta
  xmater.php
• KNIHY
• Flegr J. Evolucní biologie, Academia 2005.
• Kapitoly IX.Evoluce sekvence DNA a XXIV.
  Molekulární fylogenetika
• Avise J.C. Molecular markers, natural history
  and evolution. Sinauer Associates, Inc., 2004
• Felsenstein J. Inferring phylogenies. Sinauer
  Associates, Inc., 2004
• Lindell Bromham Reading the story of the DNA.
  Oxford University press 2008.
• Higgs P. a Attwood T.K. Bioinformatics and
  molecular evolution. Blackwell publishing 2005.
• Sapp The new foundation of evolution. Oxford
  university press 2009
• Yang Computational Molecular Evolution. Oxford
  university press 2006
• Hillis a kol. Molecular Systematics (2nd
  edition). Sinauer Associates 1996
• Wiley a Lieberman Phylogenetics (2nd edition).
  Wiley-Blackwell 2011

5
Molekulární taxonomie Co to je za obor?
Taxonomie (systematika) využívající molekulárne
biologické znaky.
Taxonomie (systematika) Snaží se katalogizovat
biodiverzitu a usporádat ji do systému obvykle
hierarchicky razených skupin.
Rozdíly v sekvenci DNA (potažmo proteinu).
Nepatrí sem znaky na jiným molekulách (lipidy,
polysacharidy, proteoglykany, terciární struktury
proteinu aj.)
6
fylogenetika
Podle vetšinového názoru taxonomu je nejlepším
prirozeným systémem organizmu ten, který odráží
prubeh jejich fylogeneze.
Fylogenetika zabývá se vznikem a vývojem linií
organizmu. Rekonstruje prubeh kladogeneze
(vetvení), ale všímá si i anageneze vývoje
vlastností organizmu v rámci linie.
7
Taxony

• Základním požadavkem na prirozený taxon je jeho
  monofyleticnost.
• Monofyletický taxon je
• takový, jehož clenové si jsou vzájemne príbuzní
  více, než je kdokoli z nich príbuzný druhu mimo
• jinak receno, takový, který zahrnuje všechny
  potomky jednoho predka

Polyfyletický (neprípustný)
Parafyletický (prípustný pro evolucní taxonomy)
Monofyletický (prípustný pro evolucní taxonomy
i kladisty)
8
Taxony
Na základe znalosti fylogeneze lze urcit, které
taxony vytváret nesmíme, není však možné urcit,
které taxony vytváret máme nebo musíme.
9
ZNAK vs. FORMA ZNAKU
Znakem rozumíme cást tela, rys ci vlastnost,
která je kvazi-nezávislá na ostatních znacích.
Formou znaku rozumíme popis znaku konkrétního
organizmu používaný pro srovnání s jiným.
10
ZNAKY a jejich formy
Existují ruzné názory na použitelnost znaku pro
rekonstrukci fylogeneze Fenetika (podobnost)
používá všechny znaky
Kladistika (duraz na príbuznost)
používá výhradne synapomorfie
x1 y1 z1
x1, y1, z1 plesiomofie x2 synapomorfie pro
BCD y2 autapomorfie pro B z2 homoplázie
(konvergence) pro ED
11
Prístupy k použití znaku
Numerická taxonomie (60. minuleho století)
první pokus o objektivizaci taxonomie. Kladli
duraz na použití velkého množství dat a vyvinuli
matematické postupy, jak z nich vypocítat
celkovou podobnost (nebo naopak odlišnost -
distanci) mezi taxony. Je to tzv. fenetický
prístup. Kritizováni kladisty za to, že jim
nevadí homoplázie. Metody konstrukce stromu
oznacované jako fenetické (založené na
distancích) byly nebo jsou kladisty neprávem
zavrhovány. Kladistické metody (maximální
parsimonie) se v praxi dostávají do podobných
obtíží, nemají vodítko, jak rozeznat homoplázie a
konflikty mezi znaky reší nakonec podobne jako
fenetické metody.
12
homologie
Homologie jsou podobnosti mezi komplexními
strukturami nebo vzory, které jsou zpusobeny
kontinuitou biologické informace. (Riedl a
Hazsprunar)
Musíme si uvedomit zda posuzujeme homologii znaku
nebo konkrétní formy znaku
Synapomorfie a symplesionorfie
homologie Homoplásie ? homologie, je to analogie,
13
homologie
Homologický vztah indikuje

• Odpovídající poloha
• Podobnost v detailech

14
homologie
Homologický vztah vyvrací

• Prítomnost obou struktur u jednoho druhu

Homonomie

• Inkongruence s mnoha jinými znaky

15
homologie
Homologický vztah vyvrací

• Prítomnost obou struktur u jednoho druhu

Homonomie

• Inkongruence s mnoha jinými znaky

16
Molekulární taxonomie Co to je za obor?
Taxonomie (systematika) využívající molekulárne
biologické znaky.
Taxonomie (systematika) Snaží se katalogizovat
biodiverzitu a usporádat ji do systému obvykle
hierarchicky razených skupin.
Rozdíly v sekvenci DNA (potažmo proteinu).
Nepatrí sem znaky na jiným molekulách (lipidy,
polysacharidy, proteoglykany, terciární struktury
proteinu aj.)
17
Prekvapivé množství polymorfismu
Liší se asi ve 3 miliónech nukleotidu
Kdyby tyto ruzné alely genu menily fitness, byly
by prírodním výberem rychle eliminovány nebo
naopak fixovány a žádný polymorfismus bychom
v daných místech nepozorovali.
18
Neutrální teorie evoluce
Liší se asi ve 3 miliónech nukleotidu
Naprostá vetšina substitucí na úrovni DNA je
selekcne neutrální neutrálních, mutanti mají
stejnou fitness. Tyto mutace jsou pro selekci
neviditelné a jejich fixaci ci eliminaci
zpusobuje genetický drift (posun). Ten je u
velkých populací pomalý, obe alely tam
pretrvávají dlouho dobu a my je detekujeme jako
polymorfismy.
19
Genetický drift
20
Neutrální teorie evoluce

• Aby bylo jasno
• Neutrální teorie netvrdí, že vetšina genu je
  postradatelná, ale tvrdí, že vetšina forem (alel)
  téhož genu je funkcne stejne dobrá.
• Neutrální teorie netvrdí, že nejsou mutace se
  škodlivým efektem, které jsou eliminovány
  prírodním výberem, ale tvrdí že takových mutací
  je menšina.
• Neutrální teorie nezavrhuje darwinistickou
  adaptivní evoluci pohánenou prírodním výberem,
  ale tvrdí, že vetšina mutací je pro prírodní
  výber neviditelná a k adaptivní evoluci
  neprispívá.
• Neutrální teorie nejlépe vysvetluje, kde se bere
  tolik polymorfismu (rozdílu) v DNA.

21
Výhody molekulárních znaku
1. Jsou genetické Víme jak se dedí, nezávisí na
prostredí ani genetickém pozadí. Je to práve ta
úroven kde vznikají evolucní novinky mutace v
DNA. 2. Je jich obrovské množství Velikost
genomu se pohybuje od 0,5106 600109. Lidský
genom obsahuje pres 3 miliardy páru bazí.
Odhaduje se, že lidé se mezi sebou liší v 0,1 tj
3 miliónech bazí.
22
Výhody molekulárních znaku
3. Jsou selekcne neutrální Podle nich snadneji
rozlišíme homologii a homoplázii
Sup africký
Sup africký
Kondor andský
23
Výhody molekulárních znaku
4. Jsou použitelné od tech nejvzdálenejších
srovnání
24
Výhody molekulárních znaku
4. až po porovnávání jedincu téhož druhu
25
Výhody molekulárních znaku
5. Dají se jednoznacne popsat 6. Jsou
nezávislé 7. Jsou lépe vážitelné 8. Lépe se
kvantifikuje stupen nejistoty
26
Výhody molekulárních znaku

• Molekulární hodiny
• Informace o populaci

27
Nevýhody molekulárních znaku

• Neposkytují informaci o anagenezi
• Cena
• Nekdy destruktivní charakter

28
Historie 60. léta
Linus Pauling, Emile Zuckerkandl (Molecules as
Documents of Evolutionary History, 1964)
Robert Sokal, Peter Sneath (Numerical taxonomy,
1963)
Willi Henning (Phylogenetic systematics, 1966)
Luigi Cavalli-Sforza, Anthony Edwards (metody
maximální parsimonie a maximum likelihood,
1963-1966)
29
Historie 60. 90. léta
Margaret Dayhoff (Atlas of protein sequence and
structure, 1965)
Motoo Kimura (Neutral theory of evolution, 1968)
Masatoshi Nei (substitucní modely, 80. léta)
Joe Felsenstein (PHYLIP - Phylogeny Inference
Package, 1995, artefakty fylogenetických metod
long branch attraction)
(David Swofford PAUP )
30
záver

• Prirozený systém je založen na znalosti
  fylogeneze organizmu
• Je dovoleno vytváret jen monofyletické prípadne
  parafyletické taxony
• Molekulární znaky mají spoustu duležitých výhod
• Molekulární znaky jsou vhodné pro studium
  studium kladogeneze nikoli anageneze
• Molekulární znaky vznikají prevážne neutrální
  evolucí a k jejich fixací prispívá genetický
  drift

31
SEKVENACE DNA
32
Cyklus 1
PCR
Cyklická reakce zahrnující denaturaci templátu,
nasednutí primeru a polymeraci.

• Jednostranne ohranicené retezce vznikají pouze z
  puvodní DNA templátu.
• Oboustranne ohranicené retezce jsou samy sobe
  templátem, jejich pocet roste geometrickou radou
  a po 30 40 cyklech zcela preváží nad ostatní
  DNA ve vzorku.

Cyklus 2
33
Sangerova metoda - I
PCR Amplifikace
Vložení do plazmidu
Sekvenace
34
Sangerova metoda - II
Kapilární elektroforéza
35
Next generation sequencing
Díky masivní paralelizaci (najednou sekvenují
milióny templátu ) dokáží v krátkém case
vygenerovat obrovské množství sekvencí. Cena za 1
bázi podstatne klesá.
36
454 emulzní PCR
37
454 desticka
38
454 - chemie
39
454 - výstup
40
Ion torrent
41
Illumina vazba na sklícko
42
Illumina - amplifikace
43
Illumina - Ctení
44
Illumina - Ctení
45
Real Time sequencing

• Pacific biosciences

46
záver
Porovnání nekterých parametru technologií
sekvenace DNA
Technologie Délka ctení Množství na jeden beh
Sanger 1000 bp 36 Kb
454 700 bp 0,7 Gb
Ion Torrent 400 bp 2 Gb
Illumina 300 bp (125 bp) 15 GB (1000 Gb)
Pacbio RS 8500 bp 375 Mb
Metody jsou ruzne vhodné k ruzným úcelum. Na de
novo sekvenování je nejvhodnejší Sanger a 454 a
Pacbio RS. Illumina je lepší na re-sekvenování.
Nekdy je dobré metody kombinovat.