Diapositive 1

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(No Transcript)
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Missions de la Plateforme
2 missions (opérationnelle depuis 2000)
Développement
Service
Puces dediees Biomathématique Chimie de
greffage Nanobiotechnologie
Expertises et conseils
Production
Analyses
En procédure de démarche qualité Iso9001vs2000
(pour accreditation dès déménagement dans Bio5)
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Le Personnel
2 missions
Prestations de services
Recherche et développement Micro-NanoBiotechnologi
e
Lidwine Trouilh IE, CDI-SAIC service Biopuces
Jean-Marie François Pr. INSA Directeur de la
platefome Biopuces
Nathalie Duroure, thèse -MRT Technologie
biopatterning
Nathalie Marsuad IE, CDD-SAIC service
Biopuces-Affymetrix
Véronique le Berre CR1-CNRS, Biologiste Responsab
le technique Projets Nanobio axe Bio
Delphine Labourdette I.E., CDI-SAIC Administrateu
r Systeme Analyse dimages
Flavien Pillet, Thèse Cifre (ITAV) Technologie
Biopuce detection par SPR
Emmanuelle Trévisiol CR1-CNRS, Chimiste Responsabl
e RMQ Projets Nanobio-Axe chimie
stagiaires Master
Céline Declercq, IE CDI SAIC Webmaster/ chargee
de communication/gestion
Jean -José Maorte IE -INSERM Responsable Plateau
qPCR
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Equipement disponible
Analyses statistiques - Bioplot/bioclust, -
outils comerciaux genespring, - outils avec la
PF Biomath
Analyse Image -Genepix, Mapix -Feature
extraction - Expression console, TAS, GTC
Lecteurs - Innoscan 700 - GenePix 4000A/4000B -
Affymetrix scanner
Hybridation - Agilent - Ventana - Affymetrix
Plateforme Biopuces
Controles qualité des ARNs - Agilent 2100 -
Nanodrop
Production de puces
Plateau TQ (IFR-BMT)
ORGANISMES
qPCR HD - ABI Stephone -ABI7900
Analyse des données - Logiciel SDS - genex
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Modalités daccès
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Puces à spottées
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Technologie Affymetrix
9
Technologie Agilent
Feature extraction
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Technologie Nimblegen (à venir en 2010)
3-plex 3 x 720 K
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Applications

• Expression (mRNA - miRNA)
• Génotypage (CGH - hybridation génomique
  comparative ou CNV et SNP)
• ChIP chip (Regulation de lexpression des gènes
  épigénétique)
• Capture de séquence (non validé)
• Puce à protéines
• Puce à sucres (développement)

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Applications

• Expression (mRNA - miRNA)
• Génotypage (CGH - hybridation génomique
  comparative ou CNV et SNP)
• ChIP chip (Regulation de lexpression des gènes
  épigénétique)
• Capture de séquence (non validé)
• Puce à protéines
• Puce à sucres (développement)

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Expression
condition A
condition B
RNAa RNAb
Data capture and analysis
DNA arrayer
Reverse transcription
CY3 lt CY5
CY3 gt CY5
CY3 CY5
dCTP(CY3)
dCTP(CY5)
cDNA
cDNA
Mix both probes
targets
reading

Spotting
hybridation
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Expression design des puces
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Expression design des puces

• Affymetrix portfolio

Exon 1.0 ST Array
U133 Plus 2.0 Array
Gene 1.0 ST Array
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Expression design des puces
Design en 3 design de 5 en 3
ATTENTION Quelque soit le type de puces
choisies, la qualité de léchantillon de départ
est primordiale.
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Expression des miRNA
Intronic location
Intergenic location
(a)
(b)
miRNA
RNA pol II
Pri-miRNA
 miRtrons 
Pre-miRNA
Deadenylation, degradation
Endonucleolytic cleavage
miRNAs regulate 30 of protein coding genes
Oncogenes / Tumor suppressors
microRNAs regulate gene expression at the
post-transcriptional level by inhibiting the
translation of protein from mRNA or by promoting
the degradation of mRNA
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Expression des miRNA
Intronic location
Intergenic location
Haute spécificité des miRXplore Microarrays
(miltenyibiotec)
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Applications

• Expression (mRNA - miRNA)
• Génotypage (CGH - hybridation génomique
  comparative ou CNV et SNP)
• ChIP chip (Regulation de lexpression des gènes
  épigénétique)
• Capture de séquence (non validé)
• Puce à protéines
• Puce à sucres (développement)

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Génotypage
2) Preparation des échantillons DNA génomique
(gDNA) test et reference
1) Microarray
3) Marquage des échantillons gDNA Test
reference sont marqués indépendemment Cy3 et Cy5.
4) Hybridation
5) Scan
6) Analyse dimage Extraction des données brutes
Log2 ratio
7) Analyse de données Logiciels appropriés.
8) Visualisation des résultats
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Applications

• Expression (mRNA - miRNA)
• Génotypage (CGH - hybridation génomique
  comparative ou CNV et SNP)
• ChIP chip (Régulation de lexpression des gènes
  épigénétique)
• Capture de séquence (non validé)
• Puce à protéines
• Puce à sucres (développement)

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ChIP chip épigénétique
Liaison covalente des protéines à lADN, coupure
de lADN, sonication 500pb

• Identification
• Sites de fixation des facteurs de transcription
• Structure de la chromatine structure
• Méthylation

Immunoprécipitation avec un anticorps dirigé
contre la protéine dintérêt
Dégradation de la protéine
Amplification et marquage de lADN
Hybridation
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ChIP chip épigénétique
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Applications

• Expression (mRNA - miRNA)
• Génotypage (CGH - hybridation génomique
  comparative ou CNV et SNP)
• ChIP chip (Regulation de lexpression des gènes
  épigénétique)
• Capture de séquence (Actuellement non disponible
  sur la plateforme Biopuces)
• Puce à protéines
• Puce à sucres (développement)

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Capture de séquence Actuellement non disponible
sur la plateforme Biopuces
Fragment Add Linkers
Exon1
Exon2
Exon3
Exon4
Exon5
Exon6
Genomic DNA
hybridize
Wash
Elute
NimbleGen Array
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Applications

• Expression (mRNA - miRNA)
• Génotypage (CGH - hybridation génomique
  comparative ou CNV et SNP)
• ChIP chip (Regulation de lexpression des gènes
  épigénétique)
• Capture de séquence (non validé)
• Puce à protéines
• Puce à sucres (développement)

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Puces à protéines
http//www.protneteomix.com/
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Bilan des projets
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(No Transcript)
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Recherche Développement
Dendrilame
Nanospotter
Nano / Micro Technologies (E. Trevisiol, N.
Berthet V. Le Berre, F. Pillet, JM. François)
( LAAS LCC)
Nanoimprint et diffraction
SPRI Plex
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Les dendrilames - caractéristiques
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Nanospotter
Thèse de Nathalie Berthet en collaboration avec
léquipe Dr Liviu Nicu
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Micro et Nano tamponnage de Biomolécules
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Nano imprint et diffraction
Image AFM dun dépôt de dendrimères en
réseau Ligne de 500nm au pas de 1µm
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La résonnance plasmonique de surface
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Procédure expérimentale et contrôle qualité
Spotting
Dépôt avec le spotteur Q-array mini/Genetix ou
microarrays prêtes pour lutilisation .
Contrôle ARN
Bioanalyzer/Agilent (microfluidic Lab-on-a-Chip
technologie) 28S/18S ratio gt1.7
Marquage
Les ARN sont reverse transcrits avec le kit
pronto/promega direct labelling kit et marqués en
cy3 et cy5 ou autre technique appropriée au type
de lame. Vérification de lincorporation des dye
avec le Nanodrop
Etapes réalisées par la plateforme
Hybridation
machine automatique Discovery/Ventana ou four
agilent ou encore hybridation manuelle en chambre
corning
Scan
Scan Scanner Gene Pix 4000A or 4000B Innoscan
700. Génèrent des fichiers .tif
Image analysis
Gene Pix Pro 6.01 - Mapix - Feature extraction
Analyse statistique logiciel Bioplot Bioclust
ou autre
Biologistes
InterprétationsBiologiques
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Techniques de marquage

• Marquage direct
• Marquage direct des cDNA lors de la
  retrotranscription
• avec des dCTP Cy3 et dCTP Cy5
• (CyScribe First Strand cDNA Labelling Kit-
  Amersham Biosciences)

cDNA
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Importance du plan expérimental
? bien concevoir le plan expérimental pour
prendre en compte certaines sources de
variations, notamment leffet du marquage
Comparaison entre deux conditions
TEST
TEST
A
B
A
B
C
D
Cy3
Cy5
Cy5
Cy3
Cy5
Cy5
Cy3
Cy3
Cy5
Cy5
Cy3
Cy3
Cy5
Cy5
Cy3
Cy3
A
D
C
A
B
B
REFERENCE
REFERENCE
Dye-swap
Dye-switch
Le dye-swap et le dye-swich consomme le même
nombre de lames mais le dye-swich permet
d'éliminer les faux positifs dus aux variabilités
interéchantillons.