Regulaci

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Regulación de la transcripción en eucariontes.
2
El control génico en eucarióticos

• En organismos multicelulares su propósito es la
  ejecución de decisiones evolutivas precisas
• Los genes convenientes se expresan en células
  adecuadas durante el desarrollo y la
  diferenciación.
• Es el medio principal para regular la expresión
  génica en eucariontes.
• Los elementos de control se encuentran a varias
  kilobases del sito de inicio de transcripción.

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El control génico en eucarióticos

• Poseen tres tipos de RNA polimerasas.
• Tiene subunidades grandes que tienen homología
  con b y by pequeñas que tiene homología con la a
  de la RNA pol de bacterias.
• Presentan otras subunidades pequeñas.
• La RNA pol I sintetiza pre-RNA ribosomal
• La RNA pol II sintetiza mensajeros, RNA pequeños
  nucleares
• La RNA pol III sintetiza RNAr 5S, tRNA y RNAs
  estables y cortos.

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• RNA polimerasas

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Subunidad L de Pol II

• Contiene un extremo carboxilo terminal que es una
  repetición de la secuencia
• Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
• Conocido como el dominio carboxi-terminal o CTD.
• Levaduras contiene 26 repeticiones o más,
  mamíferos 52 repeticiones otros eucariontes
  intermedia.

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CTD

• Se fosforila durante la iniciación de la
  transcripción
• Permanece fosforilada durante la transcripción.

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Foto fosforilación de CTD

• Polimerasa no fosforilada verde
• Polimerasa fosforilada roja

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• Núcleos aislados se incuban con 32P-NTP (periodo
  corto).
• Se marcan entre 300-500 nucleótidos del RNA
  naciente.
• Hibridizando el RNA marcado con el DNA clonado
  para un gen específico, se puede saber cual es la
  fracción de transcripción de un gen.

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Identificación de RNA polimerasas de eucariontes

• Cromatografía en DEAE sefadex.

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Inicio de transcripción.

• La RNA pol II suele iniciar la transcripción en
  un par de bases específicos o alternativos
  cercanos a una plantilla.
• El nucleótido 5que tienen el capuchón en un mRNA
  es el nucleótido en dónde inición la
  transcripción.

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Iniciador en vez de caja TATA

• Algunos genes no presentan caja TATA.
• Presentan una secuencia relativamente degenerada
  con A en 1, Y es una pirimidina, N es cualquier
  base.

5Y-Y-A1-NT/A-Y-Y-Y(3)
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Hay genes que no presentan ni caja TATA ni
Iniciador

• Se presenta en genes de mantenimiento
  (housekeeping).
• Es una región de 20 a 200 pares de base
• Da origen a mensajeros con extremos 5 múltiples.
• Son genes que generalmente se transcriben a bajas
  tasas.
• Presentan un segmento de 20 a 50 pb rico en GC
• Este sitio es reconocido por un factor de
  transcripción llamado SP1

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Islas CpG

• Las secuencias ricas en CG son pocas en el genoma
  eucariótico
• Estas regiones justo antes de un gen presentan
  una distribución no al azar.
• Pueden ser identificadas por su susceptibilidad a
  la enzima de restricción HpaII.
• La presencia de islas CpG sugiere una zona de
  iniciación de transcripción.

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El enhancer del SV40

• Estimula la transcripción de proteínas virales en
  la infección.
• Estimula la transcripción de todos los genes
  eucariontes en que se ha probado.
• Funciona en cualquier orientación
• Funciona hasta a miles de pares de bases de sitio
  de iniciación
• Está compuesto de muchos elementos individuales
  que contribuyen individualmente a la actividad.

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Características de los enhancers

• Se han encontrado a más de 50 kilobases del
  promotor que controlan.
• Pueden estar río arriba del promotor, río abajo
  del promotor, dentro de un intrón o de un exón o
  hasta después del último exón.
• Algunos son específicos de un tipo celular.
• En los genes de las inmunoglobulinas en los
  linfocitos B, hay un enhancer dentro del segundo
  intrón pero funciona solo en linfos B.

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Elementos de control cercanos y lejanos

• Se creía que eran diferentes
• Se pueden invertir su colocación y siguen
  estimulando la transcripción.
• Son célula específico
• Ahora se piensa que son un espectro de elementos
  de control que regulan la transcripción.

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Resumen

• La expresión de los genes que codifican para
  proteínas en eucariontes están regulado por
  múltiples regiones de control que actúan en cis.
• Algunos de estos elementos de control son
  cercanos al sitio de inicio y otros lejanos.
• Los promotores determinan el sitio de inicio de
  transcripción y dirigen la unión de la RNA
  polimentasa II.

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Resumen

• Se han identificado tres tipos de secuencias
  promotoras en eucariontes.
• Caja TATA
• Promotores diferentes poco frecuentes
• Islas CpG

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Los elementos proximales

• Están dentro de los 200 pares de bases. Contiene
  hasta 20 pares de bases cada uno.

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Los enhancers,

• Usualmente contienen entre 100 y 200 pb de
  longitud. Tienen elementos de control
  individuales de 8 a 20 pb.
• Se localizan a más de 200 y hasta decenas de
  kilobases río arriba o abajo del promotor.
• Puede estar dentro de un intron o más lejos del
  último exón del gen.

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Aislamiento bioquímico de los factores de
transcripción

• Una vez que el elemento regulatorio se ha
  identificado por análisis mutacional,
• Se puede
• Identificar a la proteína cognada que se une
  específicamente a ella.
• En esta técnica, un extracto del núcleo se pasa
  por varias cromatografías y se realiza un
  footprinting con Dnasa tipo I o un ensayo de
  cambio en la movilidad electroforética (EMSA)

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• Las fracciones que contienen proteínas que se
  unen a elementos regulatorios probablemente
  contienen factores putativos de transcripción.
• La técnica más poderosa para purificar factores
  de transcripción es la cromatografía de afinidad
  en dónde se inmovilizan las secuencias de los
  elementos regulatorios a un soporte.

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• Si la transcripción del gen reportero es mayor en
  presencia de l plásmido que codifica para la
  proteína X, esta es un activador. Si es menor, X
  es un represor.

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Clasificación de los dominios de unión al DNA

• Proteínas con
• Homeodominio
• Proteínas con dedos de zinc
• Hélice alada (en lengüeta de flecha)
• Con cremallera o zipper de leucina
• Con hélice-bucle-hélice

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Homeodominio

• Proteína de Engrailed de Drosophila
• Nombre de genes homeóticos (produce la
  transformación de una parte del cuerpo en otro en
  el desarrollo.
• Región de 60 residuos de aa muy conservada

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Proteínas con dedos de zinc

• Dominio estructurado con un ion Zn2 en el centro
  de un plegamiento de residuos de aa.
• Secuencia consenso
• Tyr/Phe-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe/Tyr-X5-Leu-X2-His-X3-4
  -His
• La forma de dedo se ve en un diagrama
  bidimensional
• El zinc se fija entre las 2 Cys y la 2 His.
• Se le llama dedo C2H2

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Proteínas con dedos de zinc

• El alfa-hélice que se forma es muy compacto
• Se inserta en el surco mayor del DNA
• Otro tipo de dedos de zinc C4 se encuentra en
  otros factores de trascripción (receptores a
  esteroides-nucleares)
• Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys-X14-15-Cys-X5-Cys-X9-Cys
  -X2-Cys

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Proteínas con dedos de zinc

• Los dominios C2H2 y C4 son estructuralmente
  distintos.
• Los C2H2 tienen tres dedos repetitivos o más y se
  fijan como monómeros.
• Los C4 tienen en general dos dedos y se fijan
  como homodímeros o heterodímeros.
• Con simetría rotacional doble (fig. siguiente b)

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Dedos de zinc C2H2 (a)y C4(b)
Proteína GL1
Receptor a glucocorticoides
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Interacción entre Gal4 y el DNA

• Proteína con dedos de zinc C6 .
• Es un homodímero que se forma por una hélice
  enrollada .

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Proteínas con hélice alada

• Dominios de fijación de la histona H5
• Se unen al DNA como monómeros
• Pueden unirse al DNA Z.

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Estructura cristalina del dominio de unión al DNA
Z de la proteína Dlm-1 unida al DNA.
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Cremallera o zipper de leucina

• Hay un residuo de leucina cada 7 aminoácidos en
  la región C terminal del dominio de unión.
• Se unen al DNA en forma de dímeros, la leucina
  es necesaria para la dimerización.
• Presenta dos a-hélices extendidas que agarran al
  DNA como pinzas en dos surcos mayores en la
  región N terminal.
• Pueden ser homodímeros o heterodímeros.

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Interacción de Gnc4 con el DNA
53
Hélice bucle hélice

• Un bucle no helicoidal de la cadena polipeptídica
  separa dos regiones a-helicoidales.
• Tienen aminoácidos básicos para aumentar la
  interacción con el DNA.

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Interacción de un dominio hélice-bucle-hélice con
el DNA
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Los factores de transcripción heterodiméricos
aumentan las opciones de control génico.

• Cada monómero tiene un dominio de fijación al DNA
  con especificidad de secuencia equivalente.
• No influye en la unión al DNA.
• Permite que los dominios de activación asociados
  con cada monómero se reúnan para formar un solo
  factor de transcripción.

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Dominios de activación

• Secuencia polipeptídica que activa la
  transcripción cuando está fusionada a un dominio
  de fijación del DNA
• Muchos dominios pueden activar la transcripción.
• Casi el 1 de las proteínas de fusión resultantes
  (Gal4 y segmento al azar) activaron la
  transcripción de un gen con UASgal en 5.

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