Presentazione di PowerPoint

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Polimorfismi, mutazioni e metodi per evidenziarli
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DNA satellite
Unità da 5 a 200 bp. Segmenti lunghi fino a
qualche centinaio di chilobasi
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Polimorfismi del DNA microsatelliti
Minisatelliti Unità fino a 5 bp. Segmenti lunghi
fino a 25 kb
Allele A TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG Alle
le B TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG
Microsatelliti Unità lt 4bp. Segmenti lunghi
fino150 bp
Allele A TACCAAGGTACACACACGGTACCATGG Allele B
TACCAAGGTACACACACACGGTACCATGG Allele
C TACCAAGGTACACACACACACGGTACCATGG Allele D
TACCAAGGTACACACACACACACGGTACCATGG
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Perché i microsatelliti sono così polimorfici?
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Polimorfismi del DNA SNP (single nucleotide
polymorfism)
---ATGTTGAAGTTCAAGAATTCTGTGCGGAAC---
---ATGTTGAAGTTCAAGTATTCTGTGCGGAAC---
---ATGTTGAAGTTCAAGCATTCTGTGCGGAAC---
---ATGTTGAAGTTCAAGGATTCTGTGCGGAAC---
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Come evidenziare i polimorfismi? RFLP
restriction fragment length polymorphism
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Gli RFLP possono evidenziare sia polimorfismi
dovuti a mutazione di singoli nucleotidi (che
fanno comparire o scomarire siti di restrizione)
sia polimorfismi di tipo minisatellite (VNTR
Variable Number of Tandem Repeats)
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I polimorfismi di tipo microsatellite possono
essere evidenziati mediante PCR (STR Short
Tandem Repeat)
Due vantaggi principali rispetto agli RFLP più
facili da evidenziare (PCR), e molto più
polimorfici (elevato tasso di eterozigosità)
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I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR)
sono stati estremamente utili per ottenere una
prima mappa globale del genoma umano
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La mappa genetica ottenuta con i marcatori è
fondamentale per mappare i geni responsabili di
patologie umane (positional cloning)
La posizione di un gene malattia viene definita
valutando la frequenza di ricombinazione del
carattere fenotipico rispetto ai marcatori
polimorfici disponibili (rivedere il concetto di
linkage dalla genetica)
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I marcatori polimorfici sono molto usati nelle
indagini di medicina legale (identificazionie di
indivudui, attribuzione di paternità/maternità).
In passato si usavano gli RFLP, oggi soprattutto
gli STR (Test del DNA standard messo a punto
dallFBI analisi di 13 marcatori STR altamente
polimorfici). Luso della PCR consente di fare
diagnosi su tracce.
Quando il materiale biologico è troppo scarso o
di qualità scadente, può essere utile analizzare
i polimorfismi del DNA mitocondriale (moltissime
copie per cellula)
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Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o
pochi) nucleotidi
Amplificazione della regione mediante PCR con
oligonucleotidi fiancheggianti il punto di
interesse e successiva digestione con enzimi di
restrizione
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Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o
pochi) nucleotidi
Lutilizzo combinato della PCR e dellanalisi di
restrizione permette di diagnosticare specifiche
mutazioni molto più facilmente che con il
Southern Blot
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Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o
pochi) nucleotidi
Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e
ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici
b A
b S
P1
P1
P2
P2
PCR
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Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o
pochi) nucleotidi
Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e
ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici
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Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o
pochi) nucleotidi
Amplificazione allele-specifica
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Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o
pochi) nucleotidi
Amplificazione (di DNA genomico o cDNA) e
sequenziamento diretto.
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Lutilizzo simultaneo della PCR e di traccianti
fluorescenti consente lanalisi simultanea
(multiplex) di moltissimi polimoprfismi
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Diagnosi genetica pre-impianto
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Diagnosi genetica pre-impianto
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Diagnosi genetica pre-impianto
Possibile già oggi per malattie monogeniche per
cui sia nota la mutazione
In futuro, almeno in teoria, è probabile che
questa tecnica, in combinazione con lanalisi
simultanea di moltissimi polimorfismi, possa
permettere una valutazione di tratti genetici
complessi. Quali i vantaggi, e quali i pericoli?