GENETICA FUNCIONAL

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GENETICA FUNCIONAL

• Estudio de la expresión de genomas completos

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GENETICA FUNCIONAL
Bibliografía Nature Genetics January 1999 Vol.
21, Supplement The Chipping Forecast
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GENETICA FUNCIONAL
1) El entendimiento de los sistemas biológicos
constituidos por miles de genes requiere la
organización de las partes según sus
propiedades Similaridad de secuencia de DNA en
las regiones codificantes y reguladoras
Variaciones polimórficas entre especies y
subgrupos Tiempo y lugar de expresión de los
RNAs en el desarrollo, en respuesta a situaciones
fisiológicas y/o patológicas. Localización
subcelular de los productos génicos. 2) Este
entendimiento precisa el desarrollo de técnicas
de "visión global" de los procesos biológicos
estimación simultanea de todos los componentes.
DNA chips (o DNA microarrays) Serial Analysis
of Gene Expresion (SAGE) Differential Display
(Expresión diferencial). 3) Estas técnicas
permiten estudiar en paralelo los niveles de
expresión de muchos genes y generan información
estática (donde se expresa un gen) y dinámica
(como se relaciona la expresión de unos genes con
otros).
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DNA Chips o DNA Microarrays

• 1) Evolución histórica
• Técnica de Shouthern "Las moléculas de ácido
  nucleico marcadas de forma apropiada puede usarse
  para extraer información de muestras de de ácidos
  nucleicos fijadas a un soporte sólido" Técnicas
  de Shouthern, Northern, dot-blot, Slot-blot, etc.
  
• Fijación de clones individuales de forma
  ordenada en filtros para localizar los clones
  deseados e investigar patrones de expresión de
  genes.
• 2) Innovaciones clave
• A) Utilización de soportes sólidos no-porosos,
  que permiten la miniaturización y la detección
  fluorescente.
• Pueden inmovilizarse de forma automática hasta
  10.000 cDNAs en un soporte microscópico e
  hibridarlo con sondas marcadas.
• B) Desarrollo de métodos de síntesis in situ y a
  alta densidad, de oligonucleótidos en dichas
  superficies.
• Mediante técnicas fotolitográficas matrices
  con 400.000 oligonucleótidos distintos cada uno
  confinado en una región de 20 µm2
• Mediante la colocación in situ de los
  reactivos de síntesis por dispositivos similares
  los utilizados en las impresoras de chorro de
  tinta.
• 3) Usos propuestos
• A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.
• cDNA arrays Producidas por fijación de
  productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan
  genes específicos.
• Oligonucleotide arrays Idem pero por síntesis
  in situ de oligonucleótidos
• B) Análisis de variantes polimórficas en DNA y
  nuevas mutaciones (SNPs- Single Nucleotide
  Polymorfisms).
• Oligonucleotide arrays Para secuenciación en
  paralelo.

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Affymetrix
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Chip de vidrio
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cDNA microarray schema
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Impresión o espoteo

• Oligos , cDNA o fragmentos de PCR depositados
  sobre una superficie de vidrio

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Pen microarray robot
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Pen microarray robot
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Estación automática de hibridación
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Modelo de DNA array
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Light directed oligonucleotide synthesis
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Light directed oligonucleotide synthesis
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40,000 genes en una única matriz
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Usos propuestos para los DNA Chips o DNA
Microarrays

• A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.
• cDNA o oligonucleotide arrays Producidas por
  fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que
  representan genes específicos.
• B) Secuenciación
• Oligonucleotide arrays
• C) Genotipado
• Oligonucleotide arrays

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cDNA microarray
Blank-not expressed
Green- expressed in infection only
Red- expressed in culture only
Yellow- expressed in Both, culture and infection
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Simulación de detección
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An hybridized microarray
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cDNA Microarrays Quantitation
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cDNA Microarrays Detection Limits
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Estrategias de secuenciación con chips de DNA
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Oligonucleótidos utilizados en secuenciación por
ganancia de señal
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(No Transcript)
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Sequence analysis arrays
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Secuenciación y genotipado
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Secuenciación y genotipado
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Genotipado
Matríz con 120.000 sondas diseñada para genotipar
3.000 loci bialélicos
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SAGE

• Serial Analysis of Gene Expression

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SAGE

• Una secuencia de nucleótidos corta (tag) de 9 o
  10 pares de bases contiene suficiente información
  para identificar un transcrito.

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AE is Nia III TE is Fok I