Mutasyon Analiz Teknikleri I

1
Mutasyon Analiz Teknikleri I
Hafta VII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklasimlari

• Doç. Dr. Hilâl Özdag

2
PCR TEMELLI MUTASYON ANALIZ YÖNTEMLERI

• SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
• HA (Heteroduplex Analysis)
• CEHA/CE-SSCP (Capillary Electrophoresis HA)
• TGCE (Temperature Gradient Capillary
  Electrophoresis
• DHPLC (Denaturing High Performance Liquid
  Chromatography)

3
ELEKTROFOREZ

• Agaroz Jel Elektroforezi
• Denatüre edici olmayan (Native)
• Denatüre edici (Formaldehitli)
• Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
• Denatüre edici olmayan (Native)
• Denatüre edici (Üreli)
• Kapiller Elektroforez (CE)
• Denatüre edici olmayan (Native)
• Denatüre edici

4
ELEKTROFOREZ

• Elektroforezde nükleik asitler boy ve
  konformasyonlarina göre yürür.
• Denatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve
  RNA daha ziyade konformasyonlarina bagli olarak
  yürür.
• Denatüre edici ortamda ise bu moleküller ikincil
  yapi olusturamayacaklari için moleküler
  agirliklarina göre yürürler.

5
ELEKTROFOREZ

• Agaroz Jel Elektroforezi
• Denatüre edici olmayan (Native)
• Büyük moleküler agirlikli DNA yürütülecekse
  (genomik DNA gibi) 0.8-1 arasi jel
  hazirlanmalidir.
• PCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb
  arasi) 2lik jele ihtiyaç vardir.
• RFLP benzeri uygulamalarda birbirinden 10-20 bç
  farkli fragmentleri ayirmak için NuSieve benzeri
  agaroz türevleri ile rezolüsyon arttirilabilir.
  Metaphor agaroz ile 3-4 bç farki ayirmak
  mümkündür.

6
ELEKTROFOREZ

• Agaroz Jel Elektroforezi
• Agaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE
  (Tris Asetik asit EDTA) ile hazirlanir.
• DNA düsük voltajda uzun yürütmek gerektiginde (RE
  ile kesilmis genomik DNAyi Southern öncesi
  yürütmek gibi) TAE tamponu uygundur.
• Kisa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE
  seçilmelidir.

7
ELEKTROFOREZ

• Agaroz Jel Elektroforezi
• TBE 5X veya 10X konsantrasyonda hazirlanip 1X
  konsantrasyonda kullanilir. Uzun süre
  beklediginde çökelti olusturur.
• TAE 50X konsantrasyonda hazirlanabilir.
• TAEnin hazirlama maliyeti TBEye göre daha
  düsüktür.

8
ELEKTROFOREZ

• Agaroz Jel Elektroforezi
• Denatüre edici (Formaldehitli) RNA analizlerinde
  kullanilir. Özellikle Northern blot analizi
  yapilacaksa jeli bu sekilde hazirlamak sarttir.
  Ancak yalnizca RNAnin varligina/yokluguna ve
  bütünlügüne bakilacaksa rutin agaroz
  hazirlanabilir. Her durumda RNA analizlerinde
  jelin RNazsiz ortama uygun sekilde hazirlanmasi
  gerekmektedir.

9
ELEKTROFOREZ

• Poliakrilamid Jel Elektroforezi
• Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasinda
  Amonyum Persülfat (APS) araciligiyla TEMEDin
  katalizörlügünde çapraz baglarin olusmasi ile
  polimerlesen bir jeldir.
• APS her defasinda taze hazirlanmalidir.

10
ELEKTROFOREZ

• Poliakrilamid Jel Elektroforezi
• Akrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide
  karistirilarak çözüldükten sonra filtreden
  geçirilerek süzülmelidir.
• Akrilamid ve bisakrilamid polimerlesinceye dek
  nörotoksiktir.
• Akrilamid ve bisakrilamid arasindaki oran çapraz
  baglarla olusan porlarin çapini dolayisiyla jelin
  rezolüsyonununu belirler 191/291/391 gibi
• MDE (Mutation Detection Enhancement) Jel

11
ELEKTROFOREZ

• Kapiller Elektroforez
• Donmayan akrilamid bazli özel polimerler
  kullanilir. Bu polimerlerin nativ veya denatüre
  edici özellikte olanlari mevcuttur.

12
ELEKTROFOREZ

• PCR temelli mutasyon analiz tekniklerinde amaç
  olasi dizi degisimlerinin analiz edilen DNA
  fragmentinin konformasyonuna olan etkisinin
  tespit edilmesidir.

13
PCR TEMELLI MUTASYON ANALIZ YÖNTEMLERI
14
PCR TEMELLI MUTASYON ANALIZ YÖNTEMLERI
SSCP/HA
15
PCR TEMELLI MUTASYON ANALIZ YÖNTEMLERI
CE-HA CE-SSCP