Metodi per studiare l

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Metodi per studiare lespressione dei geni

• Northern blot
• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR)
• Ibridazione In situ
• Trascrizione In vitro
• DNA Microarray

2
Purificazione dellRNA

• Procedura
• Lisi delle cellule con un reagente che dissocia
  le nucleoproteine e inibisce la RNAsi
• Rimozione delle proteine
• Precipitazione specifica dellRNA

3
Northern blot

• Per determinare la dimensione e la quantita di
  specifici mRNA
• Studi sullespressione genica

4
Northern blot

• Elettroforesi dellRNA in gel contenente
  formaldeide per mantenere lRNA in forma
  completamente lineare
• Trasferimento dellRNA su una membrana
• Ibridazione con una sonda marcata

5
(No Transcript)
6

Gel Elettroforesi- Separa le
molecole in base alla dimensione

7
Trasferimento su supporto solido
8
Trasferimento dal gel alla membrana
9
Preparare la sonda per il Northern Blot
10
Ibridazione

• La sonda marcata e aggiunta ad una soluzione
  contenente il supporto solido che lega lRNA da
  analizzare

11
Lavaggio

• Rimozione della sonda non legata al supporto
  solido

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Rivelazione degli ibridi

• Esposizione di un film se la sonda e marcata
  radioattivamente
• Se la sonda e marcata con un enzima si procede
  alla reazione enzimatica che produce colore
  direttamente sul supporto solido

13
(No Transcript)
14
Dopo il trasferimento
gel
membrana
15
Northern blot

• La rivelazione avviene usando
• DNA marcato con radioattivo(32P)
• DNA marcato con un enzima che catalizza una
  reazione che produce luce o colore

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Northern blot
Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae
total RNA from leaves (L), germinating seeds
(Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was
hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and
ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows
ethidium bromide staining of the gel before
blotting. The numbers to the left indicate
approximate transcript sizes in kb
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Svantaggi del Northern Blot

• Richiede grandi quantita di RNA
• E un processo lungo e laborioso

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Trascrittasi Inversa-PCR

• Rivelazione di mRNA molto rari
• Analisi di RNA con pochissime quantita

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Procedura

• Purificazione dellRNA
• Aggiungere i primer
• mescolare RNA con la trascrittasi inversa per
  effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA
• Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per
  effettuare la sintesi del secondo filamento di
  cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR

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Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR)
AAAAA
5
mRNA
3
TTTTT
3
Primer 1
5
reverse transcriptase (RNA-dependent DNA
polymerase)
AAAAA
3
mRNA
5
5
TTTTT
cDNA
3
Remove RNA (RNase A)
TTTTT 5
cDNA
3
Add PCR primers
5
3
Primer 2
TTTTT
5
3
Primer 3
Add Taq polymerase. Run PCR
21
Reverse transcriptase-PCR ( RT-PCR)

Epoxide hydrolase

- - - - RT

l se r st l se r st pl
l
2027
1904
1584
947
831
564
22
Ibridazione dellRNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi
su vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro
transcription
T7/T3 or SP6 promoter
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RNA in situ hybridization
Colour substrate nitro blue tetrazolium (NBT)
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)
Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense
(a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E.
lagascae seedlings were collected 7 days after
sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy
hypocotyl, am apical meristem, ro root
24
Northern blotting
25
reverse Northern blotting
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cDNA arrays (continued)

• macro-arrays
• low-density
• filter-supported
• radioactive probes (duplicates)
• low sensitivity
• only cDNA clones spotted
• cheap

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cDNA arrays (continued)

• micro-arrays
• high-density
• glass-supported
• fluorescent probes (single slide)
• high sensitivity
• ability to spot oligonucleotides
• very expensive

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I microarrays
Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale
Un microarray è un supporto solido sul quale sono
stati posizionati diverse migliaia di cDNA in
spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene,
in quanto contiene numerose copie di un cDNA
corrispondente a tale gene.
In questo esempio i cDNA sono stati posizionati
su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati
per listologia.
29
Microarray technology
Probes
Microarray synthetized by photolithography or
EST/oligo linking
http//www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/proced
ure.htm
30
utilizzo dei microarrays
Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale
si confrontano i profili di espressione genica di
due campioni differenti. E necessario estrarre
le molecole di mRNA dai due campioni.
31
Confronto dei profili di espressione genica in
due campioni cellulari diversi
Estrazione dellmRNA dai 2 campioni di cellule
che si vogliono confrontare
(1)
(2)
Conversione in cDNA
(6)
Immagine a colori raffigurante il microarray
Marcatura con 2 fluorocromi diversi
(3)
Eccitazione della fluorescenza tramite laser
(4)
(5)
Riconoscimento tra i cDNA
provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti
sul microarray
32
Confronto dei profili di espressione genica in
due campioni cellulari diversi
I puntini gialli corrispondono a geni che sono
espressi in uguale quantità nei due campioni. I
puntini verdi corrispondono a geni maggiormente
espressi nel campione marcato col fluorocromo che
emette fluorescenza verde (ad esempio nelle
cellule normali). I puntini rossi corrispondono a
geni che sono maggiormente espressi nel campione
marcato col fluorocromo che emette fluorescenza
rossa (ad esempio nelle cellule tumorali).